雞IL-18cDNA基因的克隆表達及其對柔嫩艾美耳球蟲DNA疫苗的免疫增強作用.pdf

1、雞球蟲病是雞球蟲寄生在細胞內(nèi)的原蟲疾病，給養(yǎng)禽業(yè)所帶來的經(jīng)濟損失較為嚴重。實踐證明，早期臨床抗球蟲藥控制和活蟲苗的應用，在養(yǎng)禽業(yè)球蟲的防治上具有重要作用。但大量耐藥株以及活苗使用的不方便和低保護率，促使科學家不斷地追求抗球蟲的新方法。非藥物性防治不斷引起了人們的興趣，重組抗球蟲基因工程疫苗的研究亦獲得了較快的發(fā)展。細胞因子在調(diào)節(jié)機體免疫方面具有重要作用，不同的細胞因子類型誘導調(diào)節(jié)不同的免疫應答類型。IL-18的細胞來源種類較多，它可誘導

2、Th1型細胞因子以及某些趨化因子受體的表達，如IFN-γ、GM-CSF、TNF-a、IL-1等。在特定的組織環(huán)境中，IL-18亦可誘導Th2型細胞因子的分泌，如lL-13、IL-4等。 以LPS激活14日齡羅曼氏雛雞脾細胞，提取總mRNA，以RT-PCR法擴增編碼雞成熟IL-18蛋白的cDNA，目的基因重組于原核表達載體pBAD／myc-his B，并在大腸桿菌Top10中表達，用SDS-PAGE檢測表達產(chǎn)物。結果表明，成功克隆

3、到了雞成熟IL-18基因，其大小為510個核苷酸，編碼170個氨基酸；目的基因在L-(+)-阿拉伯糖誘導下獲得成功表達，表達蛋白的相對分子質(zhì)量為18.7KD。 為了探索重組rIL-18體外促進雞巨噬細胞吞噬和NO分泌的效應，本試驗檢測了雞激活腹腔巨噬細胞對中性紅的吞噬能力，并測定rIL-18作用于巨噬細胞后細胞培養(yǎng)液中NO的濃度。結果發(fā)現(xiàn)雞rlL-18復性蛋白(≥200ng／mL)可顯著提高巨噬細胞體外吞噬中性紅和分泌NO的能力

4、，且在一定的劑量范圍內(nèi)，呈現(xiàn)一定的量效關系，1000ng／ml復性蛋白的巨噬細胞吞噬和NO分泌效應與200ng／ml相當。lFN-γ抗血清可以干擾巨噬細胞的NO分泌，但不干擾巨噬細胞的吞噬。 利用DNA重組技術，將雞成熟IL-18完整閱讀框(ORF，510bp)和柔嫩艾美耳球蟲(E.tenalla)第2代裂殖子抗原基因MZ5-7的完整閱讀框(ORF，945bP)以共表達的形式克隆到真核表達質(zhì)粒pVAX1.0，分別構建了DNA疫苗

5、pVAX1.0-IL-18和pVAX1.0-MZ5-7。用同樣方法，將MZ5-7重組于IL-18基因的上游，構建成免疫調(diào)節(jié)型DNA疫苗pVAX1.0-MZ5-7-IL-18。三種DNA疫苗純化后，肌肉注射免疫一周齡雛雞(150μg/羽)，免疫后第八天取注射部位和非免疫雞對應部位肌肉組織，以進行RT-PCR方法檢測目的基因的轉(zhuǎn)錄情況；免疫后第十天，以Western blotting方法檢測抗原基因表達情況。結果表明，三種疫苗免疫后第八天，

6、用RT-PCR方法在注射部位分別檢測到相應的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物；Western blotting檢測結果顯示，三種重組疫苗在雞體內(nèi)均獲得表達。 proMZ5-7＋prolL-18、prolL-18＋pVAX1.0-MZ5-7、proMZ5-7＋pVAX1.0-IL-18、pVAX1.0-IL-18、pVAX1.0-MZ5-7、pVAX1.0-MZ5-7-IL-18經(jīng)腿部肌肉注射于14日齡雛雞，21日齡加強免疫一次，設立感染非免疫和非感染非免疫對

7、照組。28日齡經(jīng)口接種新鮮的E tenella孢子化卵囊，一周后宰殺全部實驗動物，并進行平均盲腸病變記分、平均增重、克盲腸內(nèi)容物卵囊數(shù)和抗球蟲指數(shù)指標的統(tǒng)計分析。結果表明，所構建的IL-18免疫調(diào)節(jié)型核酸疫苗對感染球蟲雞具有一定的保護效果，其中以pVAX1.0-MZ5-7-IL-18和prolL-18＋pVAX1.0-MZ5-7組有良好的保護效果，其病變記分分別為1.97、1.93，ACI為178.09、177.33。pVAX1.O-I