慢病毒介導(dǎo)IL-1Ra基因?qū)θ嘶ぜ?xì)胞體外轉(zhuǎn)染的研究.pdf

1、目的骨性關(guān)節(jié)炎(OA)是影響中老年人正常生活的常見(jiàn)疾病，其發(fā)病率在60歲以上的人群中，男性為5.6％，而女性為15％，給個(gè)人和社會(huì)帶來(lái)巨大的身心和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。在其發(fā)病過(guò)程中，大量炎性因子的釋放無(wú)疑扮演著重要角色，如IL-1、TNF等。近年來(lái)針對(duì)這些炎性因子的生物學(xué)功能研發(fā)開啟了一系列相關(guān)的基因療法，而在這些方法中，滑膜細(xì)胞的作用越來(lái)越受到重視?；ぜ?xì)胞釋放的炎癥介質(zhì)會(huì)造成關(guān)節(jié)內(nèi)軟骨基質(zhì)的降解，加重炎癥性改變，而其中IL-1Ra是最重要的一

2、種炎癥介質(zhì)。本實(shí)驗(yàn)中以慢病毒(Lentivirus)介導(dǎo)白介素-1受體拮抗蛋白基因(IL-1Ra)對(duì)人膝關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染，試圖以慢病毒介導(dǎo)IL-1Ra基因?qū)ぜ?xì)胞高效的轉(zhuǎn)染效率及IL-1 Ra基因在滑膜細(xì)胞中高效穩(wěn)定的表達(dá)、分泌，實(shí)現(xiàn)對(duì)炎癥介質(zhì)IL-1的拮抗作用，從而達(dá)到抑制軟骨基質(zhì)降解的目的。
　　方法體外培養(yǎng)人膝關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞，以慢病毒介導(dǎo)IL-1Ra表達(dá)的重組質(zhì)粒對(duì)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人滑膜細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染，熒光顯微鏡下觀察其是否能

3、高效轉(zhuǎn)染，并通過(guò)ELISA實(shí)驗(yàn)、免疫組化實(shí)驗(yàn)檢測(cè)轉(zhuǎn)染的基因是否能夠有效表達(dá)，最后通過(guò)細(xì)胞周期的檢測(cè)來(lái)研究基因轉(zhuǎn)染對(duì)細(xì)胞增殖速率的影響。膝關(guān)節(jié)表面置換手術(shù)中取人體膝關(guān)節(jié)滑膜組織，無(wú)菌條件下運(yùn)送至實(shí)驗(yàn)室，培養(yǎng)原代滑膜細(xì)胞，經(jīng)傳代培養(yǎng)（至P2代），細(xì)胞得以純化后進(jìn)行轉(zhuǎn)染試驗(yàn)。將P2代細(xì)胞分為3組進(jìn)行對(duì)照試驗(yàn):A組為慢病毒介導(dǎo)目的基因IL-1Ra進(jìn)行轉(zhuǎn)染;B組為陰性對(duì)照組，以單純的空白慢病毒載體進(jìn)行轉(zhuǎn)染;C組為空白對(duì)照組，只作正常的細(xì)胞培養(yǎng)。轉(zhuǎn)

4、染后72h熒光顯微鏡下觀察，以綠色光為激發(fā)光，觀察各組熒光狀態(tài)并計(jì)算轉(zhuǎn)染效率。分別收集A、B、C三組細(xì)胞轉(zhuǎn)染后72h的培養(yǎng)上清液，行ELISA實(shí)驗(yàn)測(cè)定各組中IL-1Ra蛋白表達(dá)量，分析比較經(jīng)過(guò)慢病毒介導(dǎo)IL-1Ra基因轉(zhuǎn)染的滑膜細(xì)胞是否能夠有效分泌IL-1Ra蛋白。分別收集轉(zhuǎn)染后72h的A、B、C三組細(xì)胞種植于載玻片，置于6孔板內(nèi)，培養(yǎng)24h后行DAB染色，蘇木素輕度復(fù)染，顯微鏡下觀察染色情況，計(jì)算各組細(xì)胞的IL-1Ra的表達(dá)率。

5、>　　結(jié)果慢病毒介導(dǎo)IL-1Ra基因可高效轉(zhuǎn)染人膝關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞，熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染后72h的滑膜細(xì)胞綠色熒光表達(dá)強(qiáng)烈，轉(zhuǎn)染率約為90％。ELISA實(shí)驗(yàn)測(cè)定轉(zhuǎn)染后72h的細(xì)胞培養(yǎng)上清含IL-1Ra蛋白A組為(58.723±3.156) ng/ml，B組均為(10.598±3.821)ng/ml，C組均為(11.263±6.833) ng/ml。免疫組化實(shí)驗(yàn)顯示A組細(xì)胞約95％胞質(zhì)內(nèi)可清楚看到IL-1Ra蛋白顆粒的染色，B、C兩組內(nèi)幾乎看