Gelsolin降低小鼠肝癌高淋巴道轉(zhuǎn)移力Hca-F細(xì)胞株的侵襲和運(yùn)動(dòng)能力.pdf

1、大連醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文Gelsolin降低小鼠肝癌高淋巴道轉(zhuǎn)移力HcaF細(xì)胞株的侵襲和運(yùn)動(dòng)能力姓名：王紹清申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：博士專業(yè)：病理學(xué)與病理生理學(xué)指導(dǎo)教師：唐建武20090601在淋巴道轉(zhuǎn)移潛能不同小鼠肝癌細(xì)胞系中的表達(dá)。2。構(gòu)建pSilencer—gelsolinshRNA表達(dá)載體，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Hca—F細(xì)胞并獲得gelsolin的表達(dá)水平穩(wěn)定下調(diào)的HcaF細(xì)胞株，同時(shí)建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pSilencer。無關(guān)序列HcaF細(xì)胞株作為對(duì)照。3

2、研究gelsolin在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)和下調(diào)其在HcaF細(xì)胞株的表達(dá)對(duì)小鼠肝癌細(xì)胞株HcaF在細(xì)胞增殖、細(xì)胞遷移和侵襲能力方面的影響，由此確定gelsolin與小鼠肝癌細(xì)胞淋巴道轉(zhuǎn)移潛能間的關(guān)系。方法：1采用細(xì)胞免疫組化、蛋白免疫印跡方法檢測(cè)gelsolin蛋白在HcaF、HcaP細(xì)胞株中表達(dá)有無差異，為進(jìn)一步研究肝癌淋巴道轉(zhuǎn)移的機(jī)制奠定基礎(chǔ)。2依據(jù)GeneBank中小鼠gelsolin基因序列(序列登錄號(hào)：NM一227753)合成三條sh

3、RNA的DNA模板的兩條單鏈，分別命名為gelsolinl、gelsolin2、gelsolin3和gelsolin無關(guān)序列，將pSilencerTM31H1neo質(zhì)粒雙酶切后分別與三條shRNA的DNA模板和無關(guān)序列的退火后產(chǎn)物連接，連接產(chǎn)物分別命名為pSilencershRNAgelsolin1、pSilencershRNA—gelsolin一2、pSilencer—shRNAgelsolin3、pSilencer—shRNAwg。

4、對(duì)三條pSilencershRNA表達(dá)載體經(jīng)測(cè)序鑒定準(zhǔn)確后(引物為5。GTTTTCCCAGTCACGAC3’)，將三條pSilencershRNA表達(dá)載體和無關(guān)序列對(duì)照組分別以脂質(zhì)體法穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HcaF細(xì)胞，用含40099／mlG418的完全培養(yǎng)基篩選，獲得pSilencer—shRNAgelsolin表達(dá)載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的HcaF細(xì)胞和無關(guān)序列對(duì)照組細(xì)胞。提取未處理的HcaF細(xì)胞株、穩(wěn)轉(zhuǎn)pSilencer無關(guān)序列的HcaF細(xì)胞株、穩(wěn)pSil

5、encergelsolinshRNA三條表達(dá)載體的HcaF細(xì)胞株的RNA、蛋白，RTPCR和WesternBlotting檢測(cè)shRNA轉(zhuǎn)染后HcaF細(xì)胞gelsolin在mRNA和蛋白質(zhì)水平的表達(dá)。選出下調(diào)效果最好的一組細(xì)胞株用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。3以三組細(xì)胞(分別為未處理的HcaF細(xì)胞株、穩(wěn)染了pSilencer無關(guān)序列的HcaF細(xì)胞株、穩(wěn)轉(zhuǎn)pSilencershRNAgelsolin1表達(dá)載體的HcaF細(xì)胞株)為實(shí)驗(yàn)對(duì)象。以CCK8法檢測(cè)

6、三組細(xì)胞的細(xì)胞活力和分裂增殖能力；Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)三組細(xì)胞的體外遷移能力(Transwell小室不做處理)、和侵襲能力(在Transwell上室中加人工基底膜)；分別在615小鼠足墊內(nèi)側(cè)接種三組細(xì)胞，2l06個(gè)／005ml細(xì)胞，28天后觀察各組淋巴結(jié)腫瘤轉(zhuǎn)移情況。結(jié)果：1Gelsolin在小鼠腹水型肝癌細(xì)胞系HcaF細(xì)胞和HcaP細(xì)胞胞漿中表達(dá)，Western—blot分析顯示gelsolin在HcaF細(xì)胞中高表達(dá)，在HcaP