海普諾(HPN)改善HepG2細(xì)胞胰島素抵抗作用的研究.pdf

1、目的：本課題通過(guò)高糖高胰島素誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞建立胰島素抵抗模型，探究海普諾(HPN)對(duì)胰島素抵抗HepG2細(xì)胞葡萄糖消耗量的影響，和對(duì)胰島素抵抗HepG2細(xì)胞內(nèi)蛋白水平及磷酸化水平改善作用，并初步探討可能的分子生物學(xué)機(jī)制，為HPN的進(jìn)一步的開(kāi)發(fā)利用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法：
　　1.用Cell Counting Kit-8（CCK-8）法研究不同濃度的 HPN對(duì)肝癌細(xì)胞株(HepG2)細(xì)胞活性的影響。體外培養(yǎng) HepG2細(xì)

2、胞，CCK-8法檢測(cè)濃度為（1×10-7～1×10-4 mo l/L）的 HPN作用Hep G2細(xì)胞后24 h，36 h和48 h的存活率。以及在倒置顯微鏡下觀看各個(gè)濃度的HPN作用Hep G2細(xì)胞48 h細(xì)胞形態(tài)的變化。
　　2.胰島素抵抗 HepG2細(xì)胞模型的建立。實(shí)驗(yàn)設(shè)立對(duì)照組和模型組，將含有胰島素培養(yǎng)液中培養(yǎng)的 Hep G2細(xì)胞作為模型組，不含胰島素的培養(yǎng)液中培養(yǎng)的 Hep G2細(xì)胞為正常對(duì)照組。以濃度為30 mmo l/

3、L D-葡萄糖和不同濃度的胰島素（1×10-7～5×10-6 mol/L）的培養(yǎng)基培養(yǎng)HepG2細(xì)胞72 h，后換正常的培養(yǎng)基持續(xù)6 h后檢測(cè)細(xì)胞上清液中葡萄糖消耗量，以確定高糖高胰島素誘發(fā)的 Hep G2細(xì)胞胰島素抵抗造模最佳胰島素濃度。
　　3.胰島素抵抗模型建立以后，用不同濃度的 HPN作用胰島素抵抗 Hep G2細(xì)胞6 h，用多功能自動(dòng)生化儀葡萄糖-己糖激酶法檢測(cè)不同濃度的 HPN對(duì) Hep G2細(xì)胞上清液中的葡萄糖消耗量

4、的影響。
　　4.蛋白免疫印跡法（Western blot）檢測(cè)HPN處理的胰島素抵抗HepG2細(xì)胞6 h后細(xì)胞內(nèi) PTP-1B，IRS-1，Akt蛋白的蛋白水平以及 IRS-1(Tyr612)酪氨酸磷酸化，Akt（Ser473）絲氨酸磷酸化水平。
　　結(jié)果：
　　1. CCK-8結(jié)果顯示在低濃度時(shí) HPN促進(jìn) HepG2細(xì)胞增殖的作用，細(xì)胞活性與HPN濃度的呈負(fù)相關(guān)，并對(duì)時(shí)間的依賴性不明顯；倒置顯微鏡下觀看細(xì)胞形態(tài)及

5、數(shù)量有明顯改變，尤其在HPN濃度為1×10-4 mo l/L時(shí)。
　　2.高糖和高糖高胰島素均能誘導(dǎo) Hep G2細(xì)胞胰島素抵抗模型的建立，誘發(fā) Hep G2細(xì)胞胰島素抵抗造模最佳胰島素濃度為1×10-6 mo l/L，D-葡萄糖濃度為30 mmo l/L。
　　3.在胰島素抵抗 Hep G2細(xì)胞中，在 HPN濃度為5×10-8～1×10-7 mo l/L時(shí)都能促進(jìn)胰島素抵抗 HepG2細(xì)胞葡萄糖消耗（P<0.05），尤其當(dāng)

6、 HPN濃度為1×10-7 mo l/L時(shí)，能顯著促進(jìn)胰島素抵抗HepG2細(xì)胞葡萄糖消耗（P<0.01）。
　　4.經(jīng)Western Blot結(jié)果檢測(cè)顯示，經(jīng)HPN處理的胰島素抵抗HepG2細(xì)胞中較模型組 PTP-1B蛋白表達(dá)水平有明顯的下降，IRS-1蛋白表達(dá)水平有明顯升高，而 IRS-1(Tyr612)的酪氨酸磷酸化；雖其下游 PI3K/Akt信號(hào)通路中Akt蛋白沒(méi)有明顯變化，但能引起Akt（Ser473）的絲氨酸的磷酸化水平

7、有明顯升高，故 HPN促進(jìn)胰島素信號(hào)通路下傳，增強(qiáng)胰島素刺激的葡萄糖攝取。
　　結(jié)論：
　　HPN能明顯促進(jìn)胰島素抵抗 HepG2細(xì)胞的葡萄糖攝取和增強(qiáng)胰島素信號(hào)下傳，可能通過(guò)抑制細(xì)胞內(nèi) PTP-1B蛋白水平的表達(dá)，增強(qiáng)胰島素信號(hào)中IRS-1蛋白表達(dá)，提高 IRS-1(Tyr612)酪氨酸磷酸化，和影響其下游 PI3K/Akt信號(hào)通路中Akt(Se r473)絲氨酸磷酸化水平，提高對(duì)胰島素敏感性，從而達(dá)到改善胰島素抵抗的目的