野馬追提取物總黃酮改善2型糖尿病模型大鼠及HepG2細(xì)胞胰島素抵抗作用及其機(jī)制研究.pdf

1、研究背景：
　　胰島素抵抗（IR）在2型糖尿病和心血管病的發(fā)病機(jī)制中起到重要作用，改善IR是2型糖尿病患者治療的一個(gè)主要目標(biāo)。目前，現(xiàn)有的針對(duì)IR的藥物（如二甲雙胍和噻唑烷二酮類）并不能保持血糖在正常范圍內(nèi)，并且有顯著的副作用。因此，從天然藥物中尋找能改善胰島素抵抗的藥物，具有重要的臨床意義。近年來提出了“糖尿病是糖脂病”的概念，使脂代謝紊亂與2型糖尿病發(fā)病機(jī)制的相關(guān)研究越來越得到重視。肝臟是調(diào)節(jié)血糖的重要臟器，肝臟 IR的主要表

2、現(xiàn)是脂代謝紊亂。包括 FFA的輸出增加，肝臟甘油三酯的含量增加及 LDL分泌增加，胰島素抑制肝葡萄糖輸出的效應(yīng)減弱，最終導(dǎo)致肝糖原含量的下降，血糖升高。野馬追提取物總黃酮為我課題組采用傳統(tǒng)的水煎煮法加有機(jī)溶劑提取制得，經(jīng)指紋圖譜分析，主要成分為金絲桃苷、槲皮素和山柰素。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，野馬追提取物總黃酮可通過多途徑、多靶點(diǎn)調(diào)節(jié)機(jī)體脂質(zhì)代謝紊亂。大量研究表明，金絲桃苷、槲皮素和山柰素均能調(diào)節(jié)血糖和血脂的動(dòng)態(tài)平衡，具有良好的降糖和改善

3、胰島素抵抗的作用。單味中藥野馬追提取物總黃酮（LEH）作為多種有效黃酮類化合物的混合物，對(duì)胰島素抵抗的作用，目前尚無研究報(bào)道。因此本研究擬主要觀察胰島素抵抗肝細(xì)胞在胰島素刺激后PI3K-Akt通路關(guān)鍵蛋白及GLUT2蛋白的表達(dá)，以及野馬追提取物總黃酮治療后上述蛋白表達(dá)的變化，從而探討LEH改善胰島素抵抗的作用的可能機(jī)制。
　　研究目的：
　　胰島素受體底物IRS蛋白是胰島素信號(hào)傳導(dǎo)的基礎(chǔ)，磷脂酰肌醇-3激酶-蛋白激酶 B通路

4、是主要的傳導(dǎo)途徑，發(fā)生胰島素抵抗時(shí)， PI3K-Akt通路關(guān)鍵蛋白（如IRS蛋白、PI3K蛋白、Akt蛋白、GLUT蛋白等）的表達(dá)均發(fā)生改變，通路活性降低。因此本研以2型糖尿病胰島素抵抗大鼠和IR-HepG2細(xì)胞為研究對(duì)象，野馬追總黃酮為干預(yù)手段，重點(diǎn)觀察在胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)下，PI3K-Akt通路關(guān)鍵蛋白 IRS-1、IRS-2、PI3K-p85、p-AktThr308、GLUT-2、PDX-1的表達(dá)，以及野馬追總黃酮治療后上述蛋白表達(dá)的

5、變化，從而探討野馬追總黃酮改善胰島素抵抗的作用及其機(jī)制。
　　第一部分野馬追提取物總黃酮的制備及質(zhì)量控制：
　　主要試驗(yàn)方法：
　　分別采用大孔樹脂法、有機(jī)溶劑提取法，制得野馬追提取物1-5號(hào)，采取藥效學(xué)篩選的辦法，最終確定水煎煮后乙酸乙酯提取法。以提取液中的總黃酮為考察指標(biāo)，再采用3因素，每因素3水平，用L9(33)正交試驗(yàn)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，并采用直觀分析法進(jìn)行分析，以取得野馬追總黃酮提取工藝優(yōu)化條件。用HPLC法同時(shí)測(cè)定野

6、馬追提取物中金絲桃苷、槲皮素和山柰素含量，更全面地控制野馬追提取物總黃酮的質(zhì)量。
　　主要研究結(jié)果：
　　1.利用可見-紫外掃描儀確定野馬追總黃酮的測(cè)定波長(zhǎng)為510nm，確定了測(cè)定野馬追總黃酮的方法。
　　2.野馬追總黃酮的最佳提取方法為水煎煮后乙酸乙酯提取法。提取最佳工藝參數(shù)為：采用水煎煮3次，加水量為藥材量的12倍，第一次1.5小時(shí)，第二次、第三次各1小時(shí)。將濾液濃縮稠膏，加入硅藻土，混勻，干燥，粉碎成細(xì)粉，得顆粒

7、。采用乙酸乙酯回流提取5次，每次回流1小時(shí)。濾過，濃縮既得。
　　3.野馬追總黃酮提取液中，分別含金絲桃苷0.0533 mg/ml，槲皮素0.0151 mg/ml、山柰素0.0215 mg/ml。以總黃酮計(jì)，總黃酮含量為0.0899mg/ml（1.7983mg/g生藥）。
　　第二部分2型糖尿病胰島素抵抗大鼠模型的建立與評(píng)價(jià)
　　主要試驗(yàn)方法：
　　將雄性SD大鼠喂以高脂高糖飼料8周，誘發(fā)出高血脂和胰島素抵抗，繼

8、而給予35 mg/kg鏈脲佐菌素（STZ）一次性腹腔注射，導(dǎo)致胰島素分泌障礙，誘發(fā)高血糖，建立實(shí)驗(yàn)性2型糖尿病大鼠模型。應(yīng)用高胰島素-正葡萄糖鉗夾技術(shù)對(duì)模型動(dòng)物進(jìn)行胰島素敏感性評(píng)價(jià)，以判斷2型糖尿病胰島素抵抗模型是否建立成功。
　　主要研究結(jié)果：
　　與普通飼料組相比，高脂高糖飼料組大鼠出現(xiàn)高血脂，STZ腹腔注射一周后，血糖明顯增高，空腹血糖>7.8mmol/L，達(dá)到糖尿病的診斷標(biāo)準(zhǔn)。高脂高糖飼料+STZ組大鼠葡萄糖輸注速度

9、（GIR）胰島素敏感性指數(shù)（ISI）顯著降低，胰島抵抗指數(shù)（HOMA-IR）顯著升高，空腹血漿胰島素顯著升高，提示高脂高糖飼料+STZ組成功建立了2型糖尿病胰島素抵抗模型。該模型具有高血糖、高血脂、伴有輕度胰島β細(xì)胞受損，機(jī)體呈明顯的胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)等特點(diǎn)，是研究2型糖尿病胰島素抵抗相關(guān)疾病的理想模型。
　　第三部分野馬追提取物總黃酮對(duì)2型糖尿病大鼠胰島素抵抗敏感性與糖脂代謝的影響及其機(jī)制研究
　　主要試驗(yàn)方法：
　　1

10、.建立2型糖尿病大鼠模型，給與野馬追總黃酮灌胃6周治療，并與吡格列酮治療對(duì)比，觀察其對(duì)胰島素抵抗的改善作用及其對(duì)糖脂代謝的影響。
　　2.應(yīng)用 Western Blot技術(shù)檢測(cè)2型糖尿病大鼠肝細(xì)胞 IRS-1、IRS-2、GLUT-2、p-AktThr308、t-Akt、PI3K-p85蛋白表達(dá)水平。
　　3.應(yīng)用 Western Blot技術(shù)檢測(cè)2型糖尿病大鼠胰腺組織 PDX-1蛋白表達(dá)水平。
　　主要研究結(jié)果：

11、r>　　1．2型糖尿病胰島素抵抗模型組大鼠 FBG、FINS、TG、TC、LDL-C、FFAs水平較正常組均顯著升高（P<0.05或P<0.01），GIR顯著降低、ISI顯著升高、HOMA-IR顯著降低（P<0.05或P<0.01）。藥物干預(yù)后，與模型組相比，野馬追總黃酮可一定程度的降低模型組大鼠FBG、FINS、TG、TC、LDL-C、FFAs水平，提高GIR，降低ISI，升高HOMA-IR（P<0.05或P<0.01），改善胰島素抵

12、抗。
　　2．2型糖尿病胰島素抵抗模型組大鼠肝組織中SOD活性顯著降低，MDA含量顯著升高，肝糖原和肌糖原含量顯著降低。野馬追總黃酮可顯著的升高肝組織中SOD活性，降低MDA含量，升高肝糖原和肌糖原含量。
　　3．從病理切片觀察2型糖尿病胰島素抵抗模型組大鼠肝臟出現(xiàn)脂肪變性，野馬追總黃酮可一定程度的減輕肝臟的脂變程度。
　　4.2型糖尿病胰島素抵抗模型組大鼠肝組織中 IRS-1、IRS-2、GLUT-2、p-AktTh

13、r308蛋白表達(dá)水平較正常組均顯著下降，同時(shí)PI3K-p85蛋白過度表達(dá)。野馬追總黃酮可顯著的升高肝組織中IRS-1、IRS-2、GLUT-2、p-AktThr308蛋白表達(dá)水平，同時(shí)抑制PI3K-p85蛋白的過度表達(dá)。
　　5.2型糖尿病胰島素抵抗模型組大鼠胰腺組織中PDX-1蛋白的表達(dá)水平顯著下降，野馬追總黃酮可顯著的升高PDX-1蛋白的表達(dá)水平。
　　第四部分野馬追總黃酮提取液改善 HepG2細(xì)胞胰島素抵抗作用及其機(jī)制

14、研究
　　主要試驗(yàn)方法：
　　1.采用高胰島素（1×10-6 mol/L）作用于 HepG2肝細(xì)胞，建立胰島素抵抗的肝細(xì)胞模型。以吡格列酮為陽性對(duì)照藥，評(píng)價(jià)野馬追總黃酮對(duì)HepG2細(xì)胞胰島素抵抗的影響。
　　2.應(yīng)用 Western Blot技術(shù)檢測(cè) HepG2肝細(xì)胞 IRS-1、IRS-2、GLUT-2、p-AktThr308、t-Akt、PI3K-p85蛋白表達(dá)水平。
　　3.運(yùn)用免疫熒光染色技術(shù)，根據(jù)熒光所

15、表達(dá)的部位和強(qiáng)度來判斷待測(cè)目的蛋白在細(xì)胞內(nèi)的定位以及用藥干預(yù)后蛋白表達(dá)的變化。
　　主要研究結(jié)果：
　　1.胰島素抵抗的肝細(xì)胞模型最佳造模胰島素濃度為1×10-6 mol/L，最佳作用時(shí)間為48 h。予以胰島素抵抗的肝細(xì)胞野馬追總黃酮（0.50g生藥/ml）處理，野馬追總黃酮可以明顯增加細(xì)胞葡萄糖的消耗量，改善IR-HepG2細(xì)胞的胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)。
　　2. IR-HepG2細(xì)胞中IRS-1、IRS-2、GLUT-2、

16、p-AktThr308蛋白表達(dá)水平較正常組均顯著下降，同時(shí)PI3K-p85蛋白過度表達(dá)。野馬追總黃酮可顯著的升高肝組織中 IRS-1、IRS-2、GLUT-2、p-AktThr308蛋白表達(dá)水平，同時(shí)抑制PI3K-p85蛋白的過度表達(dá)。
　　3.運(yùn)用免疫熒光染色技術(shù)觀察，結(jié)果表明：在 IR-HepG2細(xì)胞內(nèi)GLUT2、phospho-AktThr308表達(dá)明顯減少，PI3K-p85蛋白過度表達(dá)。經(jīng)野馬追總黃酮處理后，可以明顯地看見