堆形艾美耳球蟲孢子化卵囊cDNA文庫構(gòu)建與抗原基因篩選.pdf

1、雞球蟲病是由艾美耳球蟲寄生于雞腸道所引起的一種危害嚴重的全球性寄生蟲病，給養(yǎng)雞業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失。目前控制球蟲病的主要方法包括化學(xué)藥物防治和疫苗免疫預(yù)防，但由于這些方法存在安全、價格以及抗藥蟲株出現(xiàn)等問題，迫切需要尋找新的防治手段來控制球蟲病。研制高效安全抗球蟲病基因工程疫苗的關(guān)鍵在于尋找到重要的蟲體抗原基因。 本研究首先利用傳統(tǒng)生物學(xué)方法對實驗所選的堆形艾美耳球蟲(Eimeria acervulina)蟲株進行了鑒定，包括潛

2、在期、寄生部位、最短孢子化時間、卵囊形狀、卵囊大小及孢子囊大小等。利用SMARTTM eDNA文庫構(gòu)建試劑盒成功構(gòu)建了堆形艾美耳球蟲孢子化卵囊eDNA文庫，文庫庫容量為4.7×106pfw/mL，重組率為98％；擴增后的文庫滴度為4.4×1010pfu/mL插入片段平均大小約為1000 bp。用堆形艾美耳球蟲孢子化卵囊可溶性抗原免疫兔血清篩選構(gòu)建的eDNA文庫，獲得6個陽性克隆，PCR鑒定1～3號陽性克隆的插入片段大小約為1000bp，

3、4～6號克隆約為1500 bp。隨機選取1個陽性克隆(dui10)進行測序，將所得序列與GenBank進行對比分析，發(fā)現(xiàn)dui10為-新基因(GenBank登錄號：EU590120)，該基因有1個完整開放閱讀框，編碼163個氨基酸，生物信息學(xué)分析顯示該新基因含有1個蛋白激酶C磷酸化位點、1個N-糖基化位點、2個酪蛋白激酶II磷酸化位點、4個N端豆蔻酰基化位點。另外，利用PCR方法從構(gòu)建的堆形艾美耳球蟲孢子化卵囊eDNA文庫中擴增出了巨噬

4、細胞移動抑制因子基因(macrophage migration inhibitory factor，MIF)，將該基因連接到原核表達載體pET28a(+)，成功構(gòu)建了重組表達質(zhì)粒pET28a-MIF，并在大腸桿菌BL21(DE3)中誘導(dǎo)表達，利用鎳親和層析柱純化重組蛋白pET28a-MIF，Western-blot分析，結(jié)果表明重組蛋白pET28a-MIF具有良好的抗原性。 本研究成功構(gòu)建了堆形艾美耳球蟲孢子化卵囊eDNA文庫，