毒害艾美耳球蟲(chóng)配子體抗原基因的克隆表達(dá)與功能研究.pdf

1、毒害艾美耳球蟲(chóng)配子體抗原基因的克隆表達(dá)與功能研究C l o n i n g ．e x p r e s s i o na n d f u n c t i o nr e s e a r c ho fg a m e t o c y t e l o n i n ae x r e s s l o na n I u n c t l o n r e s e a g a m e t o c y t e ，a n t i g e n g e n e s

2、o i - 也Z 所e r i an e c a t r t x· ^ 1 r ’● ■ 一■博士生：劉丹丹導(dǎo) 師：陶建平教授專 業(yè)：預(yù)防獸醫(yī)學(xué)資助項(xiàng)目：江蘇省高校自然科學(xué)基金重大項(xiàng)目( 1 l K J A 2 3 0 0 0 2 )教育部高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專項(xiàng)科研基金 ( 2 0 1 2 3 2 5 0 1 1 0 0 0 2 )江蘇省普通高校研究生科研創(chuàng)新計(jì)劃( C x z z l 2 ．0 9 1 3 )揚(yáng)州大學(xué)2 0

3、1 4 年62 揚(yáng)州大學(xué)博士學(xué)位論文大小在2 9k D a 左右，主要以包涵體的形式存在。W e s t e r n b l o t 結(jié)果顯示，重組蛋白r E n G A M 2 2能識(shí)別抗6 ×H I S 標(biāo)簽單抗和鼠抗r E n G A M 2 2 多抗，也能被毒害、柔嫩和巨型艾美耳球蟲(chóng)的康復(fù)血清識(shí)別。免疫組化分析結(jié)果顯示，E n g a m 2 2 基因表達(dá)產(chǎn)物定位在成壁體、卵囊壁和孢子囊壁，不見(jiàn)于第二代裂殖體。熒光定量

4、P C R 結(jié)果顯示，E n g a m 2 2 基因在不同發(fā)育階段的表達(dá)情況與熒光定位結(jié)果相一致，表明E n g a m 2 2 基因在第二代裂殖體或裂殖子階段不轉(zhuǎn)錄，在配子體發(fā)育階段轉(zhuǎn)錄并表達(dá)，其表達(dá)產(chǎn)物參與卵囊壁的形成。隨后，用相同的方法通過(guò)R T - P C R 擴(kuò)增獲得毒害艾美耳球蟲(chóng)E n g a m 5 9 和E n g a m 5 6 基因，并對(duì)兩者的序列測(cè)序和序列分析。結(jié)果顯示，E n g a m 5 9 基因全長(zhǎng)為1

5、4 7 3b p ，其中包含一個(gè)完整的開(kāi)放閱讀框，大小為1 4 7 3b p ，編碼4 9 0 個(gè)氨基酸，含有一個(gè)富含酪氨酸和絲氨酸的特殊性結(jié)構(gòu)域，與柔嫩艾美耳球蟲(chóng)E t g a m 5 9 基因的同源性為9 3 ．4 ％，與巨型艾美耳球蟲(chóng)E r n g a m 5 6 基因的同源性為6 1 ．4 ％。E n g a m 5 6 基因全長(zhǎng)為9 1 8b p ，含有一個(gè)富含酪氨酸和絲氨酸的特殊性結(jié)構(gòu)域，與E m g a m 5 6 的同源

6、性為7 3 ．2 ％，與E n g a m 5 9 同源性為6 3 ．2 ％，與E t g a m 5 9 的特異性為6 0 ．9 ％。選取E n g a m 5 9 和E n g a m 5 6 基因中免疫原性較強(qiáng)的片段，設(shè)計(jì)特異性引物，擴(kuò)增得到產(chǎn)物分別為6 8 7 b p 和5 2 2 b p ，分別構(gòu)建原核表達(dá)質(zhì)粒p E T 2 8 a ( + ) ．E n g a m 5 9 和p E T 2 8 a ( + ) ．E n g

7、a m 5 6 ，成功誘導(dǎo)表達(dá)。融合蛋白大小分別約為2 8 k D a( r E n G A M 5 9 ) 和2 4 k D a ( r E n G A M 5 6 ) ，主要以包涵體的形式存在。重組蛋白均能識(shí)別抗6X H I S 標(biāo)簽單抗，并能分別識(shí)別鼠抗a n t i ．r E n G A M 5 9 多抗和鼠抗a n t i ．r E n G A M 5 6 多抗，也均能與毒害艾美耳球蟲(chóng)康復(fù)血清發(fā)生特異性反應(yīng)。免疫組化分析結(jié)果顯

8、示，E n g a m 5 9 和E n g a m 5 6 基因表達(dá)產(chǎn)物主要存在于成壁體與卵囊壁，表明兩者表達(dá)的產(chǎn)物參與卵囊壁的形成。最后，將純化復(fù)性的重組蛋白r E n G A M 2 2 按不同劑量免疫無(wú)球蟲(chóng)感染雛雞，免疫2 次后除非免疫非攻蟲(chóng)組外，其余各試驗(yàn)組雛雞均感染毒害艾美耳球蟲(chóng)孢子化卵囊，以卵囊減少率、病變記分、平均增重等為指標(biāo)，評(píng)價(jià)重組蛋白的免疫保護(hù)效果，并檢測(cè)其誘導(dǎo)的特異性免疫應(yīng)答水平。試驗(yàn)共進(jìn)行2 次。結(jié)果顯示，r