柔嫩艾美耳球蟲抗原基因TA4和EtMIC-,4-的克隆與原核表達(dá)載體的構(gòu)建.pdf

1、TA4基因是柔嫩艾美耳球蟲(E.tenella)孢子化卵囊的一個表面抗原基因，其表達(dá)的蛋白具有一定的免疫原性；EtMIC4是編碼E.tenella細(xì)胞器微線蛋白的基因，在子孢子及裂殖子階段表達(dá)，分泌的蛋白向后覆蓋于蟲體的表面，與宿主細(xì)胞表面相黏附，參與蟲體的運(yùn)動及入侵。本文以TA4基因和與球蟲入侵宿主細(xì)胞有關(guān)的EtMIC4部分基因作為研究目標(biāo)，根據(jù)Genbank中登錄的序列設(shè)計(jì)引物，利用RT-PCR技術(shù)從E.tenella(上海株)孢子

2、化卵囊中擴(kuò)增出TA4基因和EtMIC4基因的一部分。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，將大小與TA4基因預(yù)計(jì)分子量一致的片段純化后連接到pGEM-T-easy克隆載體中，再轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞，得到的轉(zhuǎn)化子經(jīng)PCR鑒定和酶切分析篩選陽性克隆；將大小與EtMIC4基因片段預(yù)計(jì)分子量一致的片段純化并經(jīng)EcoRⅠ和HindⅢ雙酶切回收后，與經(jīng)EcoRⅠ和HindⅢ雙酶切回收的pET-28-a和pET-32-a表達(dá)載體連接。結(jié)果表明：①得到了含有

3、TA4基因的陽性重組子(pGEM-TA4)，經(jīng)核苷酸測序，該序列全長773bp，其中TA4基因的閱讀框?yàn)?51bp，編碼216個氨基酸，與國外報道的TA4基因(登錄號：M21004.1)比較，序列的同源性為100﹪(773/773)。與國內(nèi)報道的TA4(浙江株)基因(登錄號：DQ327836.1)比較，序列的同源性為99﹪(765/770)，即在TA4(浙江株)基因序列的38bp、51bp、229bp、462bp和635bp處的堿基分別

4、是G、A、G、T、T而TA4(上海株)的則是A、C、A、A、C，其中51bp和229bp處堿基不同，其翻譯后相應(yīng)的氨基酸也不同，在浙江株是Met和Arg，而在上海株則是Leu和Lys，其它氨基酸相同；②得到了含有EtMIC4基因片段的陽性重組子(pET-28-a-EtMIC4和pET-32-a-EtMIC4)，經(jīng)核苷酸測序，該基因序列全長1351bp，其中基因的閱讀框?yàn)?48bp，編碼315個氨基酸，該序列與Tomley[6]等發(fā)表的序

5、列(登錄號：AJ306453.1)進(jìn)行網(wǎng)上比對后發(fā)現(xiàn)：兩者之間有99﹪(1138/1140)的同源性，即在EtMIC4(登錄號：AJ306453.1)序列的6061bp和6126bp處的堿基分別為T和G，而在EtMIC4(上海株)則是C和A；此外在EtMIC4(登錄號：AJ306453.1)序列的5510bp處比其多125個堿基，但多的堿基位于基因的閱讀框之外；與杜愛芳等[60]發(fā)表的5401基因序列(登錄號：AY819649.1)有9

6、9﹪(861/864)同源性；推測這種堿基不同的現(xiàn)象，可能是由于E.tenella不同地理株之間存在一定的遺傳差異所導(dǎo)致的。將經(jīng)測序?yàn)檎_的重組克隆質(zhì)粒(pGEM-TA4)用EcoRⅠ和HindⅢ雙酶切并回收后，與經(jīng)EcoRl和HindⅢ雙酶切回收的pET-28-c相連接；用EcoRⅠ和SalⅠ雙酶切并回收后，與經(jīng)EcoRⅠ和SalⅠ雙酶切回收的pGEX-4T-2相連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞，得到的轉(zhuǎn)化子經(jīng)PCR鑒定和酶切分析