毒害艾美耳球蟲配子體cDNA文庫的構(gòu)建與篩選及其動力蛋白基因的表達(dá).pdf

1、雞球蟲病是由一種或數(shù)種艾美耳球蟲寄生于雞消化道上皮細(xì)胞內(nèi)而引起的一種原蟲寄生蟲病，嚴(yán)重危害養(yǎng)雞業(yè)。毒害艾美耳球蟲（Eimeria necatrix）是雞球蟲病的重要病原之一，主要危害8～18周齡的雞，引起雞的急性小腸球蟲病。目前，球蟲病的防治主要依賴化學(xué)藥物或雞球蟲病活疫苗。隨著抗球蟲藥物的廣泛與大量使用，球蟲耐藥性以及人們對藥物殘留肉蛋、污染環(huán)境等諸多問題也隨之出現(xiàn)。同時活球蟲疫苗又存在生產(chǎn)成本高、容易擴(kuò)散病原、致弱蟲株毒力易返強(qiáng)、蟲

2、株的抗原變異、疫苗導(dǎo)致飼料報(bào)酬降低、疫苗接種的劑量難以控制等弊端。因此，雞球蟲保護(hù)性抗原基因的篩選與克隆表達(dá)及其免疫保護(hù)力的研究一直是雞球蟲病研究的熱點(diǎn)。為此，本文以毒害艾美耳球蟲配子體為材料，構(gòu)建毒害艾美耳球蟲配子體cDNA文庫，并用免疫學(xué)方法從文庫中篩選抗原基因，對ENH_00080190基因進(jìn)行了克隆表達(dá)和免疫原性分析，為研究毒害艾美耳球蟲亞單位疫苗奠定基礎(chǔ)。
　　1.毒害艾美耳球蟲配子體的分離與純化
　　24日齡無球

3、蟲雛雞，每雞經(jīng)嗉囊感染10000個毒害艾美耳球蟲孢子化卵囊。感染148h后收取第二代裂殖子。經(jīng)外科手術(shù)方法，將第二代裂殖子直接注入雞盲腸內(nèi)，使第二代裂殖子同步發(fā)育至配子體;手術(shù)后30 h剖檢雞，刮取盲腸黏膜，研磨后用0.5 mmol/L透明質(zhì)酸酶消化，釋放配子體;隨后經(jīng)過60目銅篩、260目錦綸篩兜和17μm PET膜過濾，濾液經(jīng)離心洗滌后用裂解液裂解紅細(xì)胞;最后用30％和50％的Percoll，5000 rpm離心15 min，分離純

4、化配子體。結(jié)果顯示，本法獲得的配子體純度高、數(shù)量多，這為研究毒害艾美耳球蟲配子體階段的基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和免疫學(xué)等奠定了基礎(chǔ)。
　　2.毒害艾美耳球蟲配子體cDNA文庫的構(gòu)建
　　用Trizol試劑提取毒害艾美耳球蟲配子體總RNA，隨后采用SMART技術(shù)構(gòu)建了毒害艾美耳球蟲配子體cDNA噬菌體表達(dá)文庫。經(jīng)鑒定，結(jié)果顯示，總RNA的OD260/OD280值為1.95，樣品的28S和18S條帶清晰，原始文庫容量為3.42×10

5、6 pfu/mL，重組率為90％，擴(kuò)增后的文庫容量為2.6×1010 pfu/mL，插入片段長度250～1000 bp。
　　3.毒害艾美耳球蟲配子體cDNA文庫的篩選
　　首先，制備抗毒害艾美耳球蟲的雞康復(fù)血清和鼠抗毒害艾美耳球蟲配子體多抗血清;兩種血清經(jīng)ELISA檢測，顯示兩種多抗均有很高的效價(jià);隨后，用制備的鼠多抗對文庫進(jìn)行篩選，初次篩選共篩出疑似5個陽性克隆，復(fù)篩后確定陽性克隆3個;最后，對復(fù)篩后獲得的陽性克隆進(jìn)行P

6、CR鑒定，對獲得的EST序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析。結(jié)果顯示，3個EST序列的長度分別為734 bp、270 bp和606bp，分別編碼毒害艾美耳球蟲特有蛋白基因、毒害艾美耳球蟲動力蛋白基因和毒害艾美耳球蟲假定蛋白基因。
　　4.毒害艾美耳球蟲動力蛋白基因表達(dá)及免疫原性分析
　　首先，依據(jù)ENH00080190序列合成毒害艾美耳球蟲動力蛋白基因，并將其插入到與載體pET-28a(+)連接，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(