SIX1促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移.pdf

1、目的：惡性增殖和轉(zhuǎn)移是腫瘤細(xì)胞的最主要特征。本項目研究Sine oculis homeobox homolog1（SIX1）對于宮頸癌細(xì)胞增殖和腫瘤轉(zhuǎn)移的促進(jìn)作用及其機(jī)制。
　　方法：real-time RT-PCR檢測基因的表達(dá)水平。蛋白印跡、酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）和免疫組化檢測基因的蛋白水平。單熒光流式細(xì)胞術(shù)檢測表面分子的蛋白水平。免疫組化分析體內(nèi)淋巴管密度。采用Bioconductor edgeR、Onto-Tool

2、s以及Gene set enrichment analysis軟件包對The Cancer Genome Atlas（TCGA）數(shù)據(jù)庫來源的人宮頸癌測序數(shù)據(jù)進(jìn)行生物信息學(xué)分析。流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞在不同細(xì)胞周期中所占的比例。Cell Counting kit-8和軟瓊脂集落實驗用來分析腫瘤細(xì)胞的體外增殖。Transwell實驗分析腫瘤細(xì)胞的體外遷移和侵襲能力。粘附實驗分析細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）的體外粘附能力。明膠酶譜檢測細(xì)胞分泌活性M

3、MP2和MMP9的水平。流式細(xì)胞術(shù)檢測檢測腫瘤細(xì)胞的失巢凋亡。人淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞（HLECs）的遷移和成管實驗分析SIX1對體外淋巴管生成的作用。宮頸癌原位移植模型和爪墊模型檢測腫瘤細(xì)胞的體內(nèi)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移能力。實驗性轉(zhuǎn)移模型檢測腫瘤細(xì)胞的對靶器官的粘附、滲出和形成轉(zhuǎn)移灶的能力?；铙w生物發(fā)光成像以及熒光成像檢測腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。免疫沉淀研究蛋白質(zhì)之間的相互作用。染色質(zhì)免疫沉淀檢測蛋白質(zhì)與基因啟動子的結(jié)合。
　　結(jié)果：（一）在宮頸上皮內(nèi)瘤

4、變和宮頸癌中，SIX1的表達(dá)由人乳頭瘤病毒的E7癌蛋白所誘導(dǎo)。SIX1表達(dá)的增高導(dǎo)致與DNA復(fù)制有關(guān)的多基因表達(dá)的上調(diào)，包括微小染色體維持蛋白復(fù)合體（MCM2、MCM3、MCM6），DNA聚合酶α-引物酶復(fù)合體（POLA1、PRIM1、PRIM2），clamp loader(RFC3, RFC4, RFC5)，DNA聚合酶δ復(fù)合體（POLD3）以及DNA聚合酶ε復(fù)合體（POLE2）。與此相一致，SIX1的高表達(dá)促進(jìn)G1至S期細(xì)胞周期進(jìn)程

5、，并促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和腫瘤的生長。相應(yīng)的，沉默SIX1可以減慢G1至S期細(xì)胞周期進(jìn)程，并抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和腫瘤的生長。重要的是，SIX1可以更有效地促進(jìn)錨定非依賴的細(xì)胞生長，從而可能在腫瘤的侵襲浸潤生長和轉(zhuǎn)移灶中腫瘤細(xì)胞的生長起到顯著的促進(jìn)作用。（二）組織標(biāo)本免疫組化顯示，宮頸癌的淋巴管生成和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與腫瘤細(xì)胞高表達(dá)SIX1密切相關(guān)。SIX1的高表達(dá)在體內(nèi)、體外都是通過增強(qiáng)VEGF-C的表達(dá)從而增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對淋巴管生成的促進(jìn)作用。

6、SIX1增強(qiáng)TGF-β誘導(dǎo)的SMAD2和SMAD3的激活，并且與SMAD通路協(xié)同促進(jìn)VEGF-C的表達(dá)。SIX1與TGF-β協(xié)同促進(jìn)腫瘤細(xì)胞表達(dá)VEGF-C的效應(yīng)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于兩者單獨的作用。盡管TGF-β能促進(jìn)VEGF-C表達(dá)，但是TGF-β1通過直接抑制淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞的成管，從而抑制淋巴管生成。然而，TGF-β1與SIX1協(xié)同促進(jìn)的VEGF-C表達(dá)不僅直接促進(jìn)淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移和成管，而且抵抗了TGF-β1對淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞的抑制效應(yīng)。（

7、三）SIX1促進(jìn)α5和β1亞基的表達(dá)，而不調(diào)控其他與多種腫瘤預(yù)后相關(guān)的整合素的表達(dá)。SIX1通過上調(diào)α5β1表達(dá)從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的體外粘附和體內(nèi)循環(huán)系統(tǒng)中細(xì)胞滯留的能力。通過上調(diào)α5β1的表達(dá)，SIX1也增強(qiáng)了ECM-α5β1介導(dǎo)的基因表達(dá)調(diào)控，包括提高活性MMP2和MMP9的分泌、上調(diào)抗凋亡基因（BCL-XL和BCL2）、下調(diào)促凋亡基因（BIM和BAX），從而增強(qiáng)宮頸癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力。阻斷α5β1，可消除SIX1對這些基因的表達(dá)調(diào)控，

8、也消除了SIX1對腫瘤細(xì)胞侵襲能力的促進(jìn)作用。并且，沉默α5也消除了SIX1在實驗性轉(zhuǎn)移和自發(fā)性轉(zhuǎn)移模型中對發(fā)展轉(zhuǎn)移灶的促進(jìn)作用。
　　結(jié)論：SIX1在DNA復(fù)制中起到主調(diào)控因子的作用，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖。SIX1通過與TGF-β通路協(xié)同促進(jìn)VEGF-C的表達(dá)，從而促進(jìn)淋巴管生成和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。同時，SIX1通過上調(diào)α5β1的表達(dá)，增強(qiáng)宮頸癌細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移能力。這些發(fā)現(xiàn)說明SIX1在宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展和侵襲轉(zhuǎn)移中起關(guān)鍵作用。這也提