miR-27b靶向調控CDH11促進宮頸癌細胞增殖、侵襲和EMT的相關研究.pdf

1、前言:宮頸癌(cervical cancer)是女性常見的婦科腫瘤，在世界范圍內，宮頸癌的致死率位居女性惡性腫瘤第四位。雖然宮頸癌的篩查已經被廣泛普及，但是仍有大部分患者確診時位于中晚期，尤其是中國等發(fā)展中國家，而這些患者的五年生存率少于40％。值得一提的是超過三分之一的患者在經過一期治療后，發(fā)生淋巴結轉移或遠處轉移，正是出現(xiàn)轉移最終導致了患者的死亡。然而導致宮頸癌發(fā)生發(fā)展的分子機制尚不清楚。
　　小分子RNA(miRNAs)是一

2、類長約18-25核苷酸的非編碼單鏈RNA分子，它是由約70nt的前體miRNA(即pre-miRNA)經Dicer酶剪切獲得。miRNAs通過和靶基因mRNA的3'-UTR區(qū)堿基位點特異性配對引起目標mRNA的降解或抑制其翻譯，從而對靶基因的表達發(fā)揮轉錄后的調控作用。據統(tǒng)計，miRNAs調控至少1/3人類基因，表明miRNAs在腫瘤致癌過程中起到重要作用。很多研究表明miRNAs的表達失調頻繁發(fā)生于人類惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中，影響著腫瘤

3、細胞的增殖，凋亡和侵襲。一些報道表明miR-27b在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起到促癌或抑癌作用。盡管如此，miR-27b在宮頸癌的表達及作用機制尚不清楚。深入研究其作用機理將為腫瘤治療提供新的策略，有望成為腫瘤早期診斷、判斷預后的標志物和基因治療的新靶點。
　　目的:本研究旨在探討miR-27b在宮頸癌中的表達情況、可能的分子調節(jié)機制以及與宮頸癌發(fā)生發(fā)展、轉移及與臨床病理學特征的關系，為臨床治療提供新的思路及依據。研究的第一部分，我們在宮

4、頸癌細胞及組織中檢測miR-27b的表達，通過生物信息學預測，檢測到miR-27b調控的下游靶基因CDH11，檢測CDH11在宮頸癌細胞及組織中的表達及二者的相關性，探討miR-27b潛在的臨床應用價值;研究的第二部分，在宮頸癌細胞系中上調/下調miR-27b的表達，通過細胞功能試驗，觀察其對宮頸癌細胞生物學特性行為的影響;檢測分析其表達改變對靶基因CDH11的調控作用;第三部分通過Western Blot方法檢測miR-27b和宮頸癌

5、在上皮間質轉化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)之間的關系，探討miR-27b使宮頸癌細胞發(fā)生增殖、侵襲的作用機制。
　　研究方法:
　　一、實驗對象。2011年1月～2014年12月37例宮頸癌新鮮組織標本;同期正常宮頸組織標本37例;1株人表皮化永生細胞HaCaT，4株宮頸癌細胞HeLa，C33A，SiHa，CasKi。
　　二、實驗方法。1、細胞培養(yǎng):常規(guī)培養(yǎng)人宮頸癌細

6、胞株和人永生化表皮細胞。2、莖環(huán)法逆轉錄聚合酶鏈式反應(stem-loop Polymerase Chain Reaction，stem-loop PCR)檢測miR-27b在人宮頸癌組織、正常宮頸組織和人宮頸癌細胞系、永生化表皮細胞中的表達情況;實時定量逆轉錄聚合酶鏈式反應(Quantitativereal-time Polymerase Chain Reaction，qRT-PCR)檢測CDH11在宮頸癌和正常宮頸組織中的表達情況。

7、3、構建CDH11的3'-UTR野生型及突變型質粒，與mimics NC和miR-27b mimics共轉染C33A細胞，應用雙熒光素酶報告基因實驗(Luciferase)檢測熒光素酶的變化。4、選取人宮頸癌細胞株HeLa、C33A，分別轉染miR-27b mimics和miR-27b inhibitor，RT-PCR驗證轉染成功后分別應用RT-PCR和Western blot檢測miR-27b的靶基因CDH11的表達情況。5、MTT法

8、檢測miR-27b對宮頸癌細胞增殖能力的影響。6、流式細胞周期實驗檢測miR-27b對細胞周期變化的影響。7、應用Transwell實驗檢測miR-27b對細胞侵襲能力的影響。8、應用劃痕實驗檢測miR-27b對細胞遷移能力的影響。9、Westem blot檢測miR-27b對EMT相關蛋白表達的影響。
　　結果:第一部分miR-27b及CDH11在宮頸癌中的表達情況及二者相關性。
　　1、stem-loop PCR結果顯示

9、，miR-27b在人宮頸癌組織中的表達水平要高于其在正常宮頸組織中的表達，同時在4株宮頸癌細胞中的表達水平亦高于正常人表皮細胞。37例宮頸癌組織中miR-27b的表達量為0.244，正常宮頸組織中表達量0.199，兩組間差異具有統(tǒng)計學意義(p＜0.05)。2、37例宮頸癌組織CDH11的表達量為1.907，正常宮頸組織中CDH11的表達量為2.631，差異有統(tǒng)計學意義(p＜0.05)。3、Pearson相關系數分析miR-27b及CDH

10、11在宮頸癌組織表達相關性，r=-0.506，呈負相關，p＜0.05。第二部分miR-27b對宮頸癌細胞生物學特性的影響及其對靶基因CDH11的調控。1、生物信息學預測結果提示miR-27b與靶基因CDH11 mRNA的3'UTR區(qū)域169-176位點可形成互補配對結合，且該序列在多種屬間高度保守。Luciferase結果驗證了以上miR-27b與CDH11的結合位點成立:與共轉染突變型CDH11-3'UTR報告基因載體相比，共轉染mi

11、R-27b和野生型CDH11-3'UTR報告基因載體時，熒光素酶活性降低(P＜0.05)。2、選取人宮頸癌細胞株HeLa、C33A，分別轉染miR-27b mimics和miR-27b inhibitor，RT-PCR驗證轉染成功后分別應用RT-PCR和Western blot檢測miR-27b的靶基因CDH11的表達情況。上調miR-27b表達后CDH11在mRNA和蛋白水平的表達均出現(xiàn)顯著下調;下調miR-27b表達，CDH11在m

12、RNA和蛋白水平表達均出現(xiàn)顯著上調，差異均有統(tǒng)計學意義。3、在HeLa細胞下調miR-27b的表達，MTT實驗結果顯示細胞增殖能力下降;細胞周期實驗結果顯示細胞周期阻滯于G1/S期;Transwell實驗結果顯示，細胞侵襲能力下降;MTT劃痕法檢測到細胞的遷移能力下降明顯。在C33A細胞中上調miR-27b的表達，實驗結果相反。4、證實miR-27b通過調控靶基因CDH11從而誘導宮頸癌細胞的增殖和侵襲。在HeLa細胞共轉染inhibi

13、tor NC+siRNA NC、miR-27b inhibitor+siCDH11 NC或共轉染miR-27binhibitor+siCDH11;在C33A細胞共轉染mimics NC+vector、 miR-27bmimics+vector或共轉染miR-27b mimics+CDH11，通過western blot證實上調或下調CDH11能夠逆轉miR-27b對CDH11表達的影響。5、MMT實驗結果顯示敲除CDH11能夠顯著逆轉m

14、iR-27b inhibitor對HeLa細胞增殖的抑制作用;而過表達CDH11能夠顯著抑制miR-27b誘導的C33A細胞的增殖。6、流式細胞周期結果為上調CDH11能抑制miR-27b誘導的C33A細胞從G1到S期轉化;而敲除CDH11能解除miR-27b inhibitor對HeLa細胞從G1期到S期轉化的阻滯。7、劃痕實驗和侵襲實驗結果顯示上調CDH11表達，能夠逆轉miR-27b誘導引起的C33A細胞的遷移和侵襲能力的增高;而

15、敲除CDH11的表達，能夠解除miR-27b inhibitor對HeLa細胞的遷移和侵襲的抑制作用。第三部分miR-27b促使宮頸癌細胞發(fā)生EMT。1、Western blot檢測miR-27b對上皮-間質轉化蛋白E-鈣粘蛋白(E-cadherin)、波形蛋白(vimentin)、N-鈣粘蛋白(N-cadherin)表達的影響。應用miR-27b mimics上調其表達，E-cadherine表達下降，vimentin、N-cadhe

16、rin表達升高。應用miR-27b inhibitor下調其表達，E-caderine表達升高，vimentin、N-cadherin表達下降。3、敲除miR-27b/同時敲除miR-27b和CDH11、過表達miR-27b/同時過表達miR-27b和CDH11之后，western blot檢測上皮-間質轉化蛋白表達變化。結果顯示:同陰性對照組相比，敲除miR-27b后E-cadherine表達升高，vimentin、N-cadheri

17、n表達降低;而敲除miR-27b的同時再敲除CDH11，敲除miR-27b對EMT蛋白的上述作用消失，表現(xiàn)為與陰性對照組相同的結果，即E-cadherine表達下降，vimentin、N-cadherin表達升高。同樣，過表達miR-27b后，E-cadherine表達下降，vimentin、N-cadherin表達升高;而過表達miR-27b的同時再過表達CDH11，則miR-27b的表達升高所帶來的EMT蛋白表達量的改變被逆轉，表現(xiàn)

18、為與陰性對照組相同的結果，即E-cadherine表達升高，vimentin、N-cadherin表達降低。
　　結論:1、與人正常上皮細胞及宮頸組織相比，miR-27b在宮頸癌細胞及組織中呈高表達，且在宮頸癌組織中miR-27b與CDH11的表達呈負相關。2、通過Luciferase結果證實CDH11是miR-27b的直接作用靶基因。3、miR-27b能促進宮頸癌細胞的增殖和侵襲能力。4、miR-27b是通過調控靶基因CDH11