CD73過表達(dá)促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞增殖及遷移能力的作用機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　CD73是一種糖基磷脂酰肌醇錨定膜蛋白，由NT5E基因編碼。CD73具有雙重功能：首先，CD73具有水解酶活性，可催化5，-單磷酸腺苷（AMP）水解生成腺苷。腺苷是機(jī)體內(nèi)微環(huán)境中一種重要的信號分子，對機(jī)體免疫應(yīng)答具有負(fù)調(diào)控作用，因此CD73在腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸過程中發(fā)揮重要作用。其次，CD73還具有非水解酶功能，研究顯示，CD73具有信號轉(zhuǎn)導(dǎo)功能，可參與細(xì)胞的增殖、粘附等生物學(xué)行為的調(diào)控。近些年研究發(fā)現(xiàn)，CD73在多種

2、類型的腫瘤中過表達(dá)，對腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移能力具有促進(jìn)作用。臨床回顧性研究表明CD73過表達(dá)與胃癌、結(jié)直腸癌、前列腺癌等腫瘤患者的臨床病理分級、轉(zhuǎn)移、預(yù)后等指標(biāo)相關(guān)，然而CD73在宮頸癌中的作用尚未明確。本文擬利用宮頸癌細(xì)胞系Hela、SiHa為模型，通過體外構(gòu)建CD73過表達(dá)的細(xì)胞株Hela-CD73及SiHa-CD73，檢測CD73過表達(dá)對宮頸癌細(xì)胞增殖、遷移等生物學(xué)行為的影響，揭示 CD73在宮頸癌發(fā)生、發(fā)展過程中的作用，并通過進(jìn)

3、一步檢測CD73酶活性抑制劑-APCP以及CD73酶活性產(chǎn)物-腺苷對宮頸癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，分析CD73在宮頸癌細(xì)胞中的作用是否依賴其水解酶活性，最后通過檢測CD73對EGFR/Akt及VEGF/Akt通路活性的影響，初步揭示CD73在宮頸癌發(fā)生、發(fā)展過程中的作用機(jī)制。
　　方法：
　?。?）構(gòu)建CD73真核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染宮頸癌細(xì)胞系Hela及SiHa，篩選CD73過表達(dá)細(xì)胞株，RT-PCR及western-blot鑒定

4、后命名為Hela-CD73及SiHa-CD73，MTT實(shí)驗(yàn)檢測CD73過表達(dá)對宮頸癌細(xì)胞增殖速度的影響，劃痕修復(fù)實(shí)驗(yàn)檢測CD73過表達(dá)對宮頸癌細(xì)胞遷移能力的影響；
　　（2）利用CD73酶活性抑制劑-APCP處理Hela-CD73及SiHa-CD73細(xì)胞，MTT實(shí)驗(yàn)檢測APCP對過表達(dá)細(xì)胞增殖速度的影響，劃痕修復(fù)實(shí)驗(yàn)檢測 APCP對過表達(dá)細(xì)胞遷移能力的影響，流式細(xì)胞術(shù)檢測CD73酶活性抑制劑-APCP對過表達(dá)細(xì)胞凋亡、周期的影響；

5、
　?。?）利用CD73水解酶活性產(chǎn)物-腺苷處理宮頸癌細(xì)胞，MTT實(shí)驗(yàn)檢測腺苷對細(xì)胞增殖的影響，劃痕修復(fù)實(shí)驗(yàn)檢測腺苷對細(xì)胞遷移能力的影響，流式細(xì)胞術(shù)檢測腺苷對細(xì)胞凋亡、周期的影響，并用RT-PCR及western-blot技術(shù)分別檢測凋亡相關(guān)分子及蛋白（Bax、Bak、Caspase-3和Bcl-2）的表達(dá)（；
　　（4）利用RT-PCR、western-blot技術(shù)檢測CD73過表達(dá)對EGFR/Akt、VEGF/Akt通路

6、活性的影響。
　　結(jié)果：
　?。?）成功構(gòu)建了CD73過表達(dá)細(xì)胞模型Hela-CD73及SiHa-CD73，MTT實(shí)驗(yàn)及劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，CD73過表達(dá)顯著促進(jìn)了Hela、SiHa細(xì)胞的增殖和遷移能力。
　?。?）利用APCP處理Hela-CD73、SiHa-CD73細(xì)胞，并檢測其影響，結(jié)果顯示，APCP對Hela-CD73、SiHa-CD73細(xì)胞的增殖、遷移能力無影響，對其細(xì)胞凋亡及周期分布也無影響。
　　（3

7、）檢測腺苷對Hela、SiHa細(xì)胞的作用。結(jié)果顯示，高濃度腺苷可顯著抑制Hela、SiHa細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，并抑制其遷移能力。并且腺苷對Hela、SiHa細(xì)胞增殖的抑制效果與腺苷濃度與處理時間呈現(xiàn)正相關(guān)性。腺苷處理可以顯著提高促凋亡因子Bax、Bak和Caspase-3的表達(dá)水平，同時降低抑制凋亡因子Bcl-2的表達(dá)水平。
　?。?）CD73過表達(dá)可顯著上調(diào)EGFR、VEGF、Akt分子表達(dá)水平，而APCP并不能逆轉(zhuǎn)CD7

8、3過表達(dá)對EGFR、VEGF、Akt表達(dá)的上調(diào)作用。
　　結(jié)論：
　　通過對宮頸癌細(xì)胞系Hela、SiHa的體外實(shí)驗(yàn)研究，本文的結(jié)果表明，CD73過表達(dá)可以顯著促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的增殖和遷移能力，這種促進(jìn)作用并不依賴 CD73的水解酶活性，而是與EGFR/Akt及VEGF/Akt通路活性的上調(diào)有關(guān)。由于目前針對CD73非酶功能的研究較少，因此本文研究結(jié)果有助于全面理解CD73在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的調(diào)控作用，對發(fā)掘以CD73為靶點(diǎn)的