miR-20a通過調控TNKS2基因促進宮頸癌細胞遷移和侵襲.pdf

1、[目的]MicroRNA(miRNA)是一類長度約18-24nt的小分子非編碼RNA，對基因進行轉錄后水平調控，通過調節(jié)其作用基因的表達水平參與多種生理、病理過程。近幾年的研究表明，一些miRNA與人類腫瘤密切相關，直接或間接調控腫瘤的增殖和遷移過程。本研究應用Real-timePCR技術驗證了在宮頸癌組織中miR-20a表達水平發(fā)生明顯上調，然后研究了miR-20a對幾種宮頸癌細胞生長表型的影響，進一步確定了miR-20a，的調控基因

2、，從而闡明miR-20a對宮頸癌遷移和侵襲可能發(fā)揮作用的分子機制。
　　[方法]首先應用Real-timePCR技術檢測。miR-20a在人宮頸癌組織和癌旁正常組織中的差異表達，然后在兩種人宮頸癌細胞系HeLa和C-33A細胞中，過表達miR-20a或封閉miR-20a，利用MTT實驗和細胞集落形成實驗檢測細胞生長活性的變化，并利用遷移和侵襲實驗檢測細胞遷移性和侵襲性的變化。之后綜合利用生物信息學方法篩選出miR-20a的候選靶基

3、因TNKS2，并利用熒光報告載體實驗驗證miR-20a對其靶基因的直接調控作用。通過Real-timePCR和Westernblot技術檢測宮頸癌細胞中內源性靶基因mRNA水平和蛋白水平的表達變化，進一步驗證miR-20a對靶基因的調控作用。最后利用RNA干擾技術將靶基因的表達沉默后，通過MTT實驗和細胞集落形成實驗檢測細胞生長活性的變化，并利用遷移和侵襲實驗檢測細胞遷移性和侵襲性的變化，并應用Real-timePCR技術檢測TNKS2

4、在人宮頸癌組織和癌旁正常組織中的差異表達進一步研究靶基因的功能及和miR-20a的相關性。
　　[結果]Real-timePCR結果顯示，miR-20a在人宮頸癌組織中的表達明顯高于癌旁正常組織。在兩種宮頸癌細胞中，過表達miR-20a增強其功能后，細胞短期增殖能力沒有發(fā)生變化，但是集落形成能力明顯升高，細胞的遷移和侵襲能力都明顯升高。當封閉miR-20a后細胞的集落形成能力明顯升高，細胞遷移和侵襲能力都明顯下降。通過生物信息學對

5、靶基因篩選結果表明，端錨聚合酶(tankyrase2，TNKS2)為miR-20a候選靶基因，其3’-非翻譯區(qū)(3’untranslatedregion，3’UTR)包含miR-20a的潛在結合位點。熒光報告載體實驗表明，miR-20a能夠通過作用于TNKS2基因的3’非翻譯區(qū)的特定位點，對其表達進行正向調節(jié)。而在miR-20a過表達的宮頸癌細胞中，TNKS2基因的mRNA表達水平和蛋白表達水平都有明顯升高，封閉則降低，而且在宮頸癌組織

6、中TNKS2基因的mRNA表達水平明顯高于癌旁正常組織。將TNKS2基因沉默以后，細胞增殖未受到明顯影響，細胞集落形成能力則明顯降低，細胞的遷移和侵襲能力都明顯降低。
　　[結論]miR-20a能夠促進宮頸癌細胞的遷移和侵襲性并增強細胞長期的增殖能力，起到癌基因的作用。而且通過熒光報告載體實驗又顯示miR-20a與TNKS2的直接正性調控作用。在宮頸癌細胞中，miR-20a對細胞的長期增殖能力、遷移和侵襲能力有很大的影響，使TNK