HPVE7調(diào)控的RRM2促進(jìn)宮頸癌血管形成的機(jī)制研究.pdf

1、宮頸癌是導(dǎo)致全世界女性死亡的第二位惡性腫瘤，流行病學(xué)研究表明持續(xù)感染高危型HPV(human papillomaviruses)16/18是導(dǎo)致宮頸癌發(fā)生的主要原因。高危型HPV主要依賴病毒基因組編碼的兩個(gè)病毒癌基因E6/E7來誘導(dǎo)感染細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化，而高危型HPVE7又是導(dǎo)致宮頸癌發(fā)生的主要癌蛋白。E7蛋白的致癌活性主要是依賴與視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白（pRb）的結(jié)合，使其泛素化降解，從而釋放具有活性的E2F，激活E2F的靶基因表達(dá)，從而促進(jìn)

2、宮頸癌的發(fā)生發(fā)展。然而，在宮頸癌中E7/E2F下游與宮頸癌發(fā)生發(fā)展相關(guān)的精確信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路尚不清楚。因此該論文旨在探索HPVE7/E2F的下游靶通路，為宮頸癌的診斷與治療提供分子基礎(chǔ)。
　　通過分析四個(gè)公開報(bào)道的宮頸癌相關(guān)基因表達(dá)芯片數(shù)據(jù)，選取在四個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)中均表達(dá)上調(diào)2倍以上的基因。然后運(yùn)用TFSEARCH（ver.1.3）軟件預(yù)測(cè)上述哪些基因的啟動(dòng)子序列上含有E2F的結(jié)合位點(diǎn)。發(fā)現(xiàn)核糖核苷酸還原酶亞基M2基因RRM2在四個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)中

3、均表達(dá)上調(diào)2倍以上，RRM2的啟動(dòng)子區(qū)域包含兩個(gè)E2F可能的結(jié)合位點(diǎn)。這些提示RRM2可能是HPVE7調(diào)控的靶基因。
　　RRM2蛋白是核苷酸還原酶的重要組成成分，是DNA合成過程中的限速酶。核苷酸還原酶的活性與癌細(xì)胞的分裂分化密切相關(guān)。許多研究表明RRM2與腫瘤的惡性生物學(xué)行為緊密相關(guān)，如過表達(dá)RRM2與腫瘤細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移和血管生成有關(guān)。RRM2能夠激活一系列原癌基因促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)，包括NF-κB、c-myc、v-fes和鳥氨

4、酸脫羧酶等，但是RRM2調(diào)控這些原癌基因的機(jī)制尚不清楚。RRM2過表達(dá)可以促進(jìn)活性氧自由基的產(chǎn)生，活性氧能夠激活腫瘤生長(zhǎng)過程中所需的MAPK、NF-κB和AP1的活性，在腫瘤的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移和血管生成中起著重要作用。然而，目前還不清楚ROS是否參與到RRM2所介導(dǎo)的惡性腫瘤發(fā)生過程。
　　本研究通過生物信息學(xué)的預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)在RRM2啟動(dòng)子區(qū)有兩個(gè)保守的E2F結(jié)合位點(diǎn)，熒光素酶活性試驗(yàn)證明了RRM2是HPVE7下游的靶基因。HPVE7是通

5、過結(jié)合Rb蛋白，使釋放的E2F轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合到RRM2的啟動(dòng)子區(qū)調(diào)節(jié)其轉(zhuǎn)錄活性。對(duì)宮頸癌組織的免疫組化分析表明RRM2的蛋白表達(dá)水平和E7的表達(dá)呈正相關(guān)。這些結(jié)果證明了RRM2可能是HPVE7的下游靶基因。
　　其次本研究首次闡明了HPVE7通過RRM2調(diào)控HIF-1α和VEGF表達(dá)的分子機(jī)制。有研究報(bào)道，HPVE7能上調(diào)HIF-1α和VEGF的表達(dá)，而具體分子機(jī)制不明。另有研究報(bào)道，RRM2可以通過上調(diào)VEGF的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞

6、的血管生成，但其具體的調(diào)控機(jī)制尚不清楚。于是假設(shè)RRM2作為HPVE7下游的靶基因，可能是通過促進(jìn)VEGF的表達(dá)來影響宮頸癌的血管生成，從而在宮頸癌的發(fā)展中發(fā)揮作用。本文研究發(fā)現(xiàn)在宮頸癌細(xì)胞系中過表達(dá)RRM2，可以促進(jìn)活性氧(reactive oxygen species,ROS)的生成，ROS能夠激活ERK1/2信號(hào)通路使HIF-1α和VEGF的表達(dá)增加。當(dāng)加入活性氧清除劑NAC后，由過表達(dá)RRM2所引起的ERK1/2信號(hào)通路激活以及

7、HIF-1α和VEGF的表達(dá)上調(diào)被抑制。另外體外血管形成實(shí)驗(yàn)表明，由E7調(diào)控的RRM2過表達(dá)能夠促進(jìn)HUVECs的血管形成，并且RRM2促進(jìn)血管的形成是VEGF依賴的。在異種移植小鼠模型中，過表達(dá)RRM2的C33A細(xì)胞注射小鼠后，促進(jìn)了腫瘤的生長(zhǎng)，同時(shí)也增加了血管的形成密度。所以，本項(xiàng)目研究證實(shí)RRM2是受HPVE7調(diào)控的下游靶基因，HPVE7通過上調(diào)RRM2，產(chǎn)生ROS激活ERK1/2信號(hào)通路，促進(jìn)HIF-1α和VEGF的表達(dá)，進(jìn)而促