MiR-634通過(guò)調(diào)控mTOR信號(hào)途徑抑制宮頸癌細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)凋亡的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：
　　宮頸癌(cervical cancer)是全球女性發(fā)病率第二位的惡性腫瘤，僅次于乳腺癌，在某些局部地區(qū)和國(guó)家其發(fā)病率位居首位，每年大約有50萬(wàn)的新發(fā)病例，差不多其中45％的病例最終死亡[1]。我國(guó)每年新增病例約15萬(wàn)，嚴(yán)重威脅女性的健康[2]。近年來(lái)，我國(guó)加大了對(duì)宮頸癌的普查力度，使之早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷、早期治療的水平有了很大的提升，加之衛(wèi)生條件的改善和保健意識(shí)的增強(qiáng)使宮頸癌發(fā)病率及死亡率不斷下降。近20年來(lái)盡管對(duì)宮頸

2、癌的研究越來(lái)越深入，可是中晚期宮頸癌的療效未見明顯提高，治療方法的種類和特異性明顯落后。為了提高宮頸癌的療效，尋找治療宮頸癌的新途徑顯得尤為迫切。
　　雷帕霉素靶蛋白(target of rapamyein，TOR)基因是最早在酵母中發(fā)現(xiàn)的一類高度保守的蛋白激酶家族，隨后在自然界其它物種中廣泛發(fā)現(xiàn)。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中也存在結(jié)構(gòu)和功能相似的TOR蛋白，命名為哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target ofrapamyei

3、n，mTOR)。mTOR基因位于人類第1號(hào)染色體短臂的3區(qū)6帶2亞帶中，是絲/蘇氨酸蛋白激酶家族成員，mTOR基因的羧基端具有與磷脂酰肌醇3-激酶(P13K)高度同源的催化結(jié)構(gòu)域，是經(jīng)典信號(hào)傳導(dǎo)通路:磷脂酰肌醇3-激酶、蛋白激酶B和哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(P13K-Akt-mTOR)的下游基因，是該信號(hào)通路接受上游刺激并向下傳遞信號(hào)的節(jié)點(diǎn);多種腫瘤的發(fā)生與該信號(hào)通路活化及mTOR高表達(dá)密切相關(guān)，這在結(jié)腸癌、淋巴瘤、乳腺癌及鼻咽癌等多種惡

4、性腫瘤中早已有報(bào)道[3～5]。
　　MicroRNAs(miRNAs)是一類非編碼調(diào)節(jié)性小RNA分子，由21到25個(gè)核苷酸組成，miRNA前體成熟后與輔酶因子結(jié)合成RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體，與靶信使RNA(message RNA，mRNA)的3'UTR以堿基互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合，導(dǎo)致mRNA降解或轉(zhuǎn)錄后水平的抑制[6]，從而抑制靶基因mRNA的翻譯并參與調(diào)控細(xì)胞進(jìn)程，如炎癥反應(yīng)、應(yīng)激反應(yīng)、分化、凋亡及遷移等。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)miRNAs可以調(diào)控細(xì)

5、胞周期、增殖、分化、凋亡及衰老;多數(shù)腫瘤中都存在miRNAs的異常表達(dá)，它與腫瘤的發(fā)生、進(jìn)展、診斷、治療及預(yù)后密切相關(guān)，是當(dāng)前腫瘤領(lǐng)域研究熱點(diǎn)。有報(bào)道稱miR-634過(guò)表達(dá)能直接通過(guò)調(diào)控線粒體內(nèi)穩(wěn)態(tài)相關(guān)基因而激活線粒體凋亡通路、抗氧化能力及細(xì)胞自噬能力盯]。同時(shí)在異種移植小鼠模型中，有研究發(fā)現(xiàn)miR-634抑制腫瘤的生長(zhǎng)和增強(qiáng)紫杉醇的敏感性。有研究表明在惡性膠質(zhì)瘤中miR-634過(guò)表達(dá)對(duì)mTOR途徑起負(fù)調(diào)節(jié)作用[9];這為我們提供了研究

6、其它miRNAs家族成員在宮頸癌致病機(jī)理中發(fā)揮作用指明了方向。
　　本研究擬探討miR-634是否可以通過(guò)調(diào)控mTOR基因的表達(dá)影響宮頸癌細(xì)胞的生物學(xué)行為，能否以miR-634為媒介逆轉(zhuǎn)細(xì)胞的自我保護(hù)流程，影響宮頸癌細(xì)胞的增殖、侵襲及凋亡，從而提高宮頸癌化學(xué)治療及靶向治療的療效，為調(diào)控宮頸癌細(xì)胞的信號(hào)傳導(dǎo)通路及抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡提供新的思路。
　　方法與結(jié)果：
　　第一部分 MiR-634在宮頸癌組

7、織中的表達(dá)及其作用研究
　　方法:
　　1.自2013年8月至2013年12月收集煙臺(tái)毓璜頂醫(yī)院證實(shí)為宮頸鱗狀細(xì)胞癌標(biāo)本15例，所有患者術(shù)前均未進(jìn)行放、化療及其它治療。應(yīng)用Real-time PCR技術(shù)檢測(cè)miR-634在宮頸癌組織和癌旁正常組織中的差異表達(dá)。
　　2.培養(yǎng)HeLa及Siha細(xì)胞，通過(guò)構(gòu)建miR-634過(guò)表達(dá)質(zhì)粒，并檢測(cè)所構(gòu)建質(zhì)粒的有效性及轉(zhuǎn)染效率;然后將過(guò)表達(dá)質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染宮頸癌HeLa及Siha細(xì)胞中

8、，通過(guò)WST-8實(shí)驗(yàn)、克隆形成實(shí)驗(yàn)、劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell實(shí)驗(yàn)，研究過(guò)表達(dá)miR-634及封閉后對(duì)HeLa及Siha細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲的影響。
　　3.流式細(xì)胞儀檢測(cè)miR-634過(guò)表達(dá)和封閉后對(duì)HeLa及Siha細(xì)胞凋亡的影響。
　　結(jié)果:
　　1.應(yīng)用Real-time PCR技術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)與癌旁正常組織相比miR-634在宮頸癌組織表達(dá)明顯降低。
　　2.通過(guò)構(gòu)建好的miR-634過(guò)表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染He

9、La及Siha細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)miR-634的HeLa及Siha細(xì)胞其增殖、遷移及侵襲能力減弱，封閉后結(jié)果相反。
　　3.流式細(xì)胞分析儀結(jié)果顯示miR-634過(guò)表達(dá)誘導(dǎo)了HeLa及Siha細(xì)胞凋亡率的增加，而封閉miR-634時(shí)降低了HeLa及Siha細(xì)胞的凋亡率。
　　第二部分 MiR-634在宮頸癌細(xì)胞中與mTOR基因的相互關(guān)系
　　方法:
　　1.培養(yǎng)HeLa及Siha細(xì)胞，應(yīng)用Real-time PCR

10、方法及Western blot技術(shù)檢測(cè)mTOR基因mRNA和蛋白在HeLa及Siha細(xì)胞中的水平。
　　2.構(gòu)建含mTOR基因3'-UTR段和含mTOR基因3'-UTR-mut段雙熒光素酶報(bào)告基因載體，并驗(yàn)證其活性;使用lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑將不同的質(zhì)?；蛑亟M質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至HeLa及Siha細(xì)胞中，測(cè)定熒光素酶活性，分析miR-634對(duì)mTOR基因有無(wú)調(diào)控作用。
　　3.通過(guò)Real-time PCR方法及W

11、estern blot技術(shù)檢測(cè)miR-634過(guò)表達(dá)和封閉后HeLa及Siha細(xì)胞中mTOR mRNA的表達(dá)及蛋白水平的變化。
　　結(jié)果:
　　1.通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告載體實(shí)驗(yàn)證明mTOR是miR-634的靶基因之一，其3'非翻譯區(qū)包含miR-634的結(jié)合位點(diǎn);miR-634能夠通過(guò)作用于mTOR基因的3'非翻譯區(qū)(3' UTR)的特定位點(diǎn)，對(duì)其進(jìn)行負(fù)性調(diào)節(jié)。
　　2.通過(guò)Real-time PCR和Western blo

12、t技術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)miR-634后HeLa及Siha細(xì)胞中mTOR基因的mRNA和蛋白水平均明顯降低，封閉后結(jié)果相反。
　　第三部分 mTOR基因在宮頸癌組織中的表達(dá)及其作用研究
　　方法:
　　1.應(yīng)用Real-time PCR技術(shù)檢測(cè)mTOR基因在宮頸癌組織和癌旁正常組織中的差異表達(dá)。
　　2.培養(yǎng)HeLa及Siha細(xì)胞，構(gòu)建pSilencer/si-mTOR質(zhì)粒，利用RNA干擾技術(shù)封閉HeLa及Siha細(xì)

13、胞中靶基因mTOR。
　　3.采用Western blot方法驗(yàn)證pSilencer/si-mTOR質(zhì)粒的有效性。
　　4.pSilencer/si-mTOR質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HeLa及Siha細(xì)胞后通過(guò)WST-8實(shí)驗(yàn)、克隆形成實(shí)驗(yàn)、劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)特性的變化。
　　結(jié)果:
　　1.應(yīng)用Real-time PCR技術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)與癌旁正常組織相比mTOR基因mRNA的表達(dá)水平在宮頸癌組織中明顯升高。

14、
　　2.WST-8實(shí)驗(yàn)、克隆形成實(shí)驗(yàn)、劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，將mTOR基因封閉后HeLa及Siha細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲能力均下降。
　　結(jié)論：
　　1.miR-634能夠抑制HeLa及Siha細(xì)胞的增殖侵襲和遷移，起到抑癌基因的作用。
　　2.將mTOR基因封閉后，HeLa及Siha細(xì)胞增殖能力減弱，細(xì)胞集落形成和侵襲能力也明顯減弱。
　　3.在HeLa及Siha細(xì)胞中，高表達(dá)的mi