microRNa-188作用于靶基因SIX1負調控ERK信號通路抑制口腔鱗癌細胞的增殖侵襲.pdf

1、目的：摸索SIX1、miR-188在口腔鱗癌組織細胞中的生物學效應及其所能具有的能力。分析SIX1在口腔鱗癌細胞中發(fā)揮其作用所依賴的信號通路以及miR-188在口腔鱗癌細胞中的潛在分子機制。
　　方法：原發(fā)性腫瘤樣本、口腔鱗癌新鮮組織以及相對應的臨近的健康組織進行免疫組織化學;細胞培養(yǎng)、轉染;實時熒光定量PCR;Western blot;集落形成實驗;MTT實驗;流式細胞術分析細胞周期;基質膠侵襲實驗;熒光素報告實驗。
　　

2、結果：1.SIX1在口腔鱗癌中的表達:正常的口腔上皮細胞里是沒有SIX1表達陽性染色的。在80例的口腔鱗癌病理樣本里有32例的SIX1呈現(xiàn)細胞核和細胞漿陽性反應。2.SIX1對于口腔鱗癌的臨床意義:SIX1的過度表達同較高的TNM分級，瘤體不同時期以及是否有淋巴結的轉移顯著相關。3.SIX1促進口腔鱗癌細胞的增殖和侵襲:Detroit562細胞系內源增殖數(shù)量偏大，KB細胞系內源增殖數(shù)量偏小。SIX1轉染后能夠顯著上調SIX1信使RNA以

3、及相應蛋白質的表達量，siRNA基因干擾則能起到相反的作用。MTT發(fā)現(xiàn)SIX1轉染能夠增強KB細胞系的增殖能力，經過siRNA處理的Detroit562細胞系則阻礙細胞增殖。transwell實驗證明了，SIX1干擾后細胞的增殖浸潤弱化而SIX1轉染后細胞的增殖浸潤顯著增強。4.SIX1調控cyclin D1以及MMP-2:SIX1轉染能夠顯著提高cyclin D1以及MMP-2蛋白合成，SIX1干擾則抑制了這些蛋白的合成。5.SIX1

4、通過ERK信號通路調控MMP-2:SIX1過表達能夠明顯提高ERK的磷酸化能力，相反對于JNK和p38的磷酸化能力不產生改變。6.SIX1調控上皮間質轉化:SIX1過度表達能夠降低KB細胞群內E-cadherin的含量水平，相反SIX1干擾會略提高E-cadherin的含量水平。同時SIX1對Snail和Twist蛋白質的表達還具有正向調控作用。7.miR-188在口腔鱗癌細胞中表達下調:口腔鱗癌病理組織內miR-188的含量顯著下調。

5、口腔鱗癌病理組織細胞中miR-188含量較相應的健康部分為少，比值為0.457。8.miR-188在體外細胞系中的表達:Detroit562細胞群內miR-188的含量并不高，而FaDu細胞群內miR-188的含量略高。miR-188 mimic轉染能夠顯著上調Detroit562細胞系中miR-188的表達量;但是miR-188抑制劑能夠顯著下調FaDu細胞系中miR-188的含量。9.miR-188在體外能夠調控細胞的增殖和侵襲:m

6、iR-188 mimic轉染后Detroit562細胞系集落形成數(shù)目顯著降低，miR-188抑制劑轉染后FaDu細胞系集落形成數(shù)目顯著增加。基質膠侵襲實驗中Detroit562細胞系中外源性miR-188含量增加，穿過基底膠的細胞總量明顯降低。miR-188抑制劑轉染FaDu細胞系，穿過基質膠到達上層的細胞數(shù)目明顯增加。10.miR-188在體外能夠調控細胞周期進程:經過miR-188 mimic轉染后能夠抑制細胞由G1向S轉變，經過m

7、iR-188抑制劑處理的細胞系能夠促進細胞周期進程的轉變。11.miR-188上調cyclin D1，cyclin E和MMP9蛋白的表達量:經過miR-188 mimic轉染后能夠顯著下調cyclin D1，cyclin E和MMP9的表達量，miR-188抑制劑轉染能夠明顯上調以上蛋白質的表達量。12.miR-188負調控致癌基因SIX1:Detroit562細胞系轉染后，miR-188的過量表達能夠顯著減少SIX1信使RNA的表達

8、量。13.SIX1為miR-188作用的直接靶基因:載有野生型SIX1基因的Detroit562細胞系，經過miR-188mimic的轉染之后，熒光含量測定呈現(xiàn)降低的趨勢，而載有突變型SIX1基因的Detroit562細胞系中熒光強度則沒有明顯變化。表明SIX1基因的3'端非編碼區(qū)域是miR-188的直接結合位點，并通過這樣的結合下調SIX1信使RNA的表達量。miR-188與SIX1信使RNA表達量呈現(xiàn)負相關。SIX1基因干擾后發(fā)現(xiàn):

9、SIX1能夠消除siRNA SIX1對于cyclin D1以及MMP9蛋白質表達下調的影響。在SIX1基因沉默的FaDu細胞系中，使用miR-188抑制劑也未能上調cyclin D1以及MMP9蛋白質的表達量。
　　結論：1.SIX1于人類口腔鱗癌病理組織中呈過量表達。2.SIX1的過表達對于腫瘤細胞的增殖、浸潤有促進作用。3.SIX1促進腫瘤細胞增殖和浸潤的作用機制為ERK-MMP-2信號傳導以及上皮間質的轉化(EMT)。4.m