番荔枝內(nèi)酯(ACGs)通過Notch1信號通路抑制口腔鱗癌細胞的增殖及其機制初探.pdf

1、NOTCH信號通路參與細胞的增殖、分化、凋亡，在機體發(fā)育過程中發(fā)揮著重要的作用。越來越多的研究表明:Notch信號通路在多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后中扮演重要角色，但其發(fā)揮致癌或抑癌作用通常依賴于所處的細胞環(huán)境?？谇击[狀細胞癌(Oral Squamous Cell Carcinoma，OSCC)是最常見的人類惡性腫瘤之一，約占頭頸部鱗狀細胞癌(Head and Neck Squamous Cell Carcinoma，HNSCC)的9

2、0％以上，其致病機理還不清楚。最新完成的HNSCC大型隊列的全基因組研究表明人Notch1基因發(fā)生高頻突變，提示Notch1基因與OSCC的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切。番荔枝內(nèi)酯（Annonaceous acetogenins，ACGs）是從番荔枝科植物中提取的一類長鏈脂肪酸內(nèi)酯化合物，對人白血病細胞、人肝癌細胞等有很強的抑制作用，具有強效抗腫瘤活性和能逆轉(zhuǎn)多藥耐藥等特性，使其成為國內(nèi)外抗腫瘤藥研究熱點。但其對OSCC的作用和分子機制仍不明確。<

3、br>　　目的:
　　1.分析人Notch1基因在OSCC組織樣本和細胞中的基因變異和表達差異。
　　2.探討ACGs對OSCC細胞的增殖、凋亡的影響及這些影響是否通過Notch1信號通路實現(xiàn);在此基礎(chǔ)上，上調(diào)或下調(diào)Notch1信號后，分析ACGs對OSCC細胞增值的影響，為OSCC防治提供研究基礎(chǔ)。
　　方法:
　　1.通過TCGA和USCS數(shù)據(jù)庫分析人Notch1基因在OSCC中的突變、表達差異和5年病人生存

4、率。
　　2.從5例OSCC及其癌旁組織中提取RNA，用qRT-PCR檢測人Notch1基因的表達水平;通過17例OSCC及其癌旁組織的石蠟切片完成免疫組化，分析Notch1基因的表達差異。分別提取正?？谇簧掀ぜ毎蚈SCC細胞的RNA和蛋白，qRT-PCR及Western blot檢測上述兩類細胞系中Notch1及其相關(guān)蛋白的表達。
　　3.通過MTT實驗檢測ACGs對OSCC細胞增殖的影響，流式細胞技術(shù)檢測ACGs對OS

5、CC細胞凋亡的影響，同時分析ACGs作用OSCC細胞后Notch1蛋白及其轉(zhuǎn)錄因子RBP-Jκ和下游目標蛋白Hes1的表達。
　　4.采用過表達Notch1胞內(nèi)段(N1ICD)和DAPT抑制Notch1信號通路，進一步驗證ACGs通過Notch1信號通路影響OSCC細胞的增殖。
　　結(jié)果:
　　1.TCGA和USCS數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果顯示:人Notch1基因在HNSCC突變率高達20％，生存分析結(jié)果顯示Notch1表達較高

6、的病人5年生存期較長，值得關(guān)注的是大部分病人的癌組織中RBP-Jκ的表達高于癌旁組織。
　　2.qRT-PCR結(jié)果表明:在5例OSCC病人中3個病人Notch1表達水平高于其配對的癌旁組織;免疫組化結(jié)果表明:17例OSCC切片中有11例病人癌組織的Notch1呈陽性，且其中部分病人癌組織分裂期細胞染色較深，顯示強陽性結(jié)果;qRT-PCR及Western blot結(jié)果也顯示3種OSCC細胞系中Notch1的表達均高于正常口腔上皮細胞

7、NOK。
　　3.MTT實驗檢測ACGs對OSCC細胞系SCC15和SCC25增殖的影響，結(jié)果表明:ACGs對SCC15和SCC25的增殖均有抑制作用，且隨著ACGs劑量的升高，細胞凋亡數(shù)也增加，呈劑量依賴性。
　　4.通過AnnexinⅤ-FITC/PI染色和流式細胞技術(shù)發(fā)現(xiàn)ACGs誘導(dǎo)SCC15和SCC25細胞發(fā)生凋亡，特別是發(fā)現(xiàn)SCC15發(fā)生晚期凋亡。
　　5.Western blot結(jié)果表明:在ACGs作用下，

8、SCC15細胞中Notch1、RBP-Jκ和Hes1的表達均隨著劑量增加而減少，具有劑量依賴性。
　　6.成功構(gòu)建Notch1胞內(nèi)段N1ICD真核表達質(zhì)粒并在SCC15細胞中實現(xiàn)過表達。同未轉(zhuǎn)染N1ICD的SCC15細胞相比，在ACGs作用下，過表達N1ICD的SCC15細胞的增殖明顯;同未轉(zhuǎn)染N1ICD的SCC15細胞相比，在ACGs和DAPT的共同作用下，過表達N1ICD的SCC15細胞的增殖能力被明顯抑制。
　　結(jié)論:

9、
　　1.人Notch1基因在OSCC中是高頻突變基因，其表達水平同OSCC的5年生存時間有關(guān);進一步研究顯示人Notch1基因在OSCC組織和細胞水平上有較高的表達，表明人Notch1基因可能與OSCC的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。
　　2.ACGs對OSCC細胞生長增殖有抑制作用，能抑制OSCC細胞的增殖、誘導(dǎo)細胞凋亡和壞死，ACGs作用于OSCC細胞后，Notch1及RBP-Jκ和Hes1的表達下降。上調(diào)和抑制Notch1信號