融合蛋白(CREKA)-,3--tTF選擇性誘發(fā)腫瘤組織血管栓.pdf

1、利用靶向性血栓藥物對實體瘤血管的選擇性栓塞是一種新穎的抗腫瘤策略。該策略以截短的組織因子(truncated Tissue Factor，tTF)為效應因子，結(jié)合腫瘤血管靶向載體實現(xiàn)選擇性誘發(fā)腫瘤組織血管栓塞，阻斷腫瘤營養(yǎng)物質(zhì)和氧氣的供給，引發(fā)腫瘤缺血性壞死，達到抗腫瘤作用。 這種策略需要靶向至腫瘤血管的載體。CREKA五肽能夠特異性結(jié)合腫瘤血管中的凝血血漿蛋白，具有良好的腫瘤血管靶向作用，是一個理想的載體。我們通過構(gòu)建CREK

2、A與tTF融合蛋白來探討這種融合蛋白是否能夠選擇性誘發(fā)腫瘤組織血管栓塞從而達到抗腫瘤作用。 首先運用生物信息學的方法對兩者構(gòu)成的融合蛋白進行分子模擬，從理論上選定最優(yōu)的融合蛋白構(gòu)建模式。隨后，利用PCR技術(shù)構(gòu)建了含有CREKA和tTF的融合基因，并將其克隆入pET22b(+)中。通過大腸桿菌表達(CREKA)3-tTF融合蛋白，并經(jīng)鎳親和層析柱，及梯度透析復性獲得純的融合蛋白。然后，利用凝血時間，F(xiàn)X活化和結(jié)合熒光定量測定等實驗

3、在體外初步探討了該融合蛋白的活性。RBITC熒光標記融合蛋白，利用活體成像儀觀察熒光標記融合蛋白在S180移植瘤的小鼠模型的分布，組織切片法結(jié)合共聚焦熒光顯微鏡分析融合蛋白的組織定位。用融合蛋白治療S180移植瘤的小鼠模型，組織切片法分析融合蛋白對腫瘤組織血管的栓塞作用。 依據(jù)分子模型結(jié)果選定CREKA與tTF的組成模式為(CREKA)3-G4S-tTF。PCR技術(shù)構(gòu)建融合基因，測序驗證獲得正確重組載體，并成功表達于E.coil

4、 BL21。凝血時間測定和FX活化實驗證實融合蛋白具有凝血活性，熒光定量實驗證實融合蛋白能夠與凝血血漿蛋白結(jié)合?；铙w成像顯示融合蛋白主要分布于腫瘤組織中，組織切片的熒光定位證實融合蛋白定位于腫瘤組織血管內(nèi)。融合蛋白治療組小鼠的病理組織切片中觀察到腫瘤組織部分血管血栓栓塞，而在其他正常組織上未觀察到血管血栓。在S180移植瘤的小鼠模型治療中，該融合蛋白能夠地抑制S180腫瘤生長。 上述實驗結(jié)果表明(CREKA)3-tTF融合蛋白是