PTEN蛋白選擇性剪接體(UPP)抑制腫瘤活性的初步研究.pdf

1、第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源基因（phosphatase and tensin homologue deleted on chromosome10，PTEN），位于人類染色體10q23.3，其缺失和突變常常和腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。在腫瘤的基因治療領(lǐng)域，PTEN的調(diào)控自1997年被發(fā)現(xiàn)以來已成為研究的熱點，包括PTEN的乙?；?、磷酸化及泛素化。然而通過改變這些調(diào)控來治療腫瘤都有很大缺陷。比如，抑制 CK2磷酸化能夠激活 PT

2、EN從而抑制腫瘤生長，然而 CK2磷酸化對象廣泛，副作用大。多泛素化可以導致 PTEN蛋白降解，而單泛素化可以幫助PTEN蛋白實現(xiàn)細胞核轉(zhuǎn)運。這種單泛素化和多泛素化的矛盾給以PTEN泛素給以PTEN泛素化酶為靶點開發(fā)癌癥新新藥物帶來困惑。所以規(guī)避以PTEN基因治療帶來的副作用越來越得到重視。已有報道在各種不同的組織和細胞中存在一個比PTEN約大15kDa的蛋白UPP（upper PTEN），其在細胞中的豐度嚴格依賴PTEN的表達。該蛋白

3、能被分泌并作用于其他細胞。這個發(fā)現(xiàn)為規(guī)避 PTEN基因治療帶來的副作用提供了可能性。而該蛋白的活性及其作用機制目前尚未深入研究。本實驗主要目的是通過蛋白免疫技術(shù)、過表達、shRNA基因敲除等來研究UPP的表達情況及其對PI3K-Akt通路的影響。通過細胞增殖、凋亡實驗研究UPP的生物活性。
　　用抗PTEN抗體對12種不同細胞內(nèi)的蛋白行免疫印跡，發(fā)現(xiàn)UPP蛋白比PTEN蛋白大15KDa，并且緊密依賴于PTEN的表達。UPP蛋白能同

4、時被特異結(jié)合N端及C端抗原表位的抗PTEN抗體識別。這些結(jié)果提示UPP蛋白可能是PTEN翻譯后修飾或基因選擇性剪接的產(chǎn)物。用抗PTEN抗體對293T細胞內(nèi)PTEN蛋白復合物進行免疫共沉淀，SDS-PAGE電泳后，分別用抗PTEN抗體、抗ISG15抗體、抗SUMO1/2/3抗體、抗Nedd8抗體及抗ubiquitin抗體進行蛋白免疫印跡分析，發(fā)現(xiàn)PTEN和UPP蛋白只能被抗PTEN抗體而不能被其他抗體識別。說明UPP不是PTEN蛋白泛素化

5、或類似泛素化等翻譯后修飾的產(chǎn)物。分別將HA-PTEN及PTEN-HA cDNA轉(zhuǎn)染入293T細胞中，以轉(zhuǎn)染空載體及未轉(zhuǎn)染的293T細胞為對照分為4組，即無轉(zhuǎn)染組、轉(zhuǎn)染空載體組、轉(zhuǎn)染HA-PTEN組、轉(zhuǎn)染PTEN-HA組。然后用抗HA抗體對細胞內(nèi)蛋白表達行蛋白免疫印跡分析，發(fā)現(xiàn)PTEN蛋白僅在轉(zhuǎn)染HA-PTEN組及轉(zhuǎn)染PTEN-HA組被檢測到，而UPP蛋白在4組中均未檢測到。進一步驗證UPP蛋白不是PTEN翻譯后修飾的產(chǎn)物。通過轉(zhuǎn)染PTE

6、N基因的shRNA敲除293T細胞中PTEN的表達，并以錯序shRNA轉(zhuǎn)染293T細胞為對照。結(jié)果顯示實驗組 PTEN及 UPP蛋白的表達均較對照組降低。并且隨著轉(zhuǎn)染shRNA濃度的提高，兩種蛋白的表達呈相似程度的逐漸降低。提示 UPP可能是 PTEN基因轉(zhuǎn)錄選擇性剪接產(chǎn)生的同源蛋白。為了研究UPP的生物活性，分別將PTEN cDNA及UPP cDNA轉(zhuǎn)染入PC3細胞（該細胞PTEN基因缺失），以轉(zhuǎn)染空載體及UPP（G302R）&nbs

7、p;cDNA的PC3細胞為對照。蛋白免疫印跡發(fā)現(xiàn)，較對照組轉(zhuǎn)染PTEN cDNA及UPP cDNA的PC3細胞，PI3K-AKT通路受到了抑制。表明 UPP能通過其脂質(zhì)磷酸酶活性抑制PI3K-AKT通路。將空載體、PTEN cDNA、UPP cDNA及UPP（G302R）cDNA分別轉(zhuǎn)染至HepG2細胞，分4組：Vector組、PTEN組、UPP組及G302R組。cDNA遺傳霉素篩選，建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的HepG2細胞，分別在接種第1、2、3