2023年全國碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
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文檔簡介

1、第一部分
   目的:本實驗室的第一代腺病毒載體(Ad5/dE1/TK)不能復(fù)制,體內(nèi)存在時間短;第二代腺病毒載體(Ad5/dE1A/6.7K/gp19K)能復(fù)制,有一定的選擇性,病毒裂解腫瘤細胞釋放的腫瘤抗原可激發(fā)機體的特異性免役反應(yīng),對正常細胞有一定的毒性;針對以上兩種腺病毒載體缺點,本課題構(gòu)建一種具有更高腫瘤特異性的新型溶瘤腺病毒基因治療載體(Ad5/dE1A/ADP),并將該載體和癌癥治療的一個理想靶點相結(jié)合-命名為M3

2、,使之具有更高的選擇性復(fù)制能力、病毒擴增量大、高效表達靶基因、有一定程度的免疫逃避能力和對正常細胞幾無毒性的特點,具有強大的腫瘤特異性殺傷效應(yīng),為腫瘤的治療提供了一個強有力的工具。
   方法:應(yīng)用層析技術(shù)獲取腺病毒的TP-DNA,二次PCR 技術(shù)對Ad5基因組E3 區(qū)的ADP基因進行定點缺失,通過限制酶消化、連接酶連接、轉(zhuǎn)化、克隆、體外同源重組、鈣磷轉(zhuǎn)染、細胞病毒內(nèi)包裝、腺病毒單克隆純化等技術(shù)獲得重組腺病毒,通過PCR擴增、測

3、序技術(shù)對該重組腺病毒進行鑒定。CsCl梯度液超速離心獲得純化的重組腺病毒。
   結(jié)果:成功的獲得了具有高包裝效率的腺病毒TP-DNA,通過該TP-DNA和穿梭載體的同源重組獲得了正確的重組腺病毒。
   結(jié)論:獲得的重組腺病毒基因治療載體M3具有預(yù)想的各種技術(shù)特征,為研究該載體的應(yīng)用價值奠定了基礎(chǔ)。
   第二部分
   目的:對已構(gòu)建成功的這種具有更高腫瘤特異性的新型溶瘤腺病毒載體M3的基本生物學(xué)特性

4、進行鑒定,判斷該載體是否滿足本課題最初的設(shè)想。
   方法:應(yīng)用PCR檢測該載體攜帶的外源基因(反義STAT3 cDNA片段)的表達模式,外源基因的表達是否模擬了被替代的腺病毒基因(ADP)的表達模式;real-time PCR檢測ADP基因的缺失或反義STAT3 cDNA片段的插入對E3區(qū)其它基因表達的影響;CPE實驗檢測該載體對不同腫瘤細胞和正常細胞的裂解能力;病毒爆發(fā)實驗及TCID50檢測ADP基因的缺失或反義STAT3

5、cDNA片段的插入對子代病毒產(chǎn)量的影響。
   結(jié)果:M3所攜帶外源基因主要在病毒復(fù)制的晚期表達,且其表達依賴于病毒DNA的復(fù)制,與被替代的腺病毒基因(ADP)的表達模式相一致;ADP基因的缺失或反義STAT3 cDNA片段的插入對其周圍E3區(qū)的其它基因沒有產(chǎn)生顯著的影響;M3在腫瘤細胞種引起的CPE效應(yīng)遲于相應(yīng)的野生型病毒,5000倍于野生型腺病毒感染量時亦未在正常的細胞中觀察到明顯的CPE效應(yīng);ADP基因的缺失使得腫瘤細胞內(nèi)

6、子代病毒的量顯著增加。
   結(jié)論:獲得的重組腺病毒M3具有預(yù)想的各種基本生物學(xué)特性,為該載體的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。
   第三部分
   目的:驗證M3對靶蛋白的封閉效應(yīng)、體外對腫瘤細胞表型的影響和體內(nèi)的溶瘤效應(yīng)。
   方法:Western blot免疫印跡和real-time PCR檢測M3對靶蛋白的封閉及其下游效應(yīng)蛋白的調(diào)節(jié);應(yīng)用流式細胞分析技術(shù)檢測M3在體外對不同組織來源的腫瘤細胞的殺傷能力;耐藥細

7、胞株的應(yīng)用檢測M3的化療增敏作用;Transwell體外侵襲實驗觀察M3對不同腫瘤細胞侵襲能力的影響;異位及原位腫瘤移植模型檢測M3的體內(nèi)治療效應(yīng)。
   結(jié)果:Western blot結(jié)果表明M3可有效抑制腫瘤細胞內(nèi)靶蛋白STAT3的表達并下調(diào)其下游蛋白c-myc、Bcl-xL、survivin、VEGF、MMP-9和Tim3的表達,但對正常細胞HUVEC內(nèi)的STAT3的表達沒有影響;流式分析結(jié)果顯示與Ad5/dE1A及Ad5

8、/dE1A/ADP相比,M3對不同組織來源的腫瘤細胞具有強大的殺傷力,腫瘤細胞的最大凋亡率可達80%以上,顯著增強了卵巢癌耐藥細胞系C13K對藥物的敏感性;體外侵襲實驗表明M3可顯著抑制腫瘤細胞的侵襲能力;前列腺癌及胃癌皮下移植瘤動物模型的實驗結(jié)果表明瘤內(nèi)直接注射M3可顯著抑制腫瘤的生長,胃癌原位移植模型的實驗結(jié)果表明,經(jīng)靜脈注射病毒不僅可顯著抑制腫瘤的生長,同時亦顯著的抑制了胃癌細胞的腹腔種植性轉(zhuǎn)移。
   結(jié)論:重組腺病毒M

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