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文檔簡介
1、目的:溶瘤病毒(oncolytic viruse)是指能特異性感染腫瘤細(xì)胞并在腫瘤細(xì)胞中大量復(fù)制最終裂解腫瘤細(xì)胞,能作為載體將目的基因?qū)肽[瘤細(xì)胞內(nèi)。超抗原(Superantigen,SAg)是一組細(xì)菌或病毒編碼的蛋白質(zhì)分子,其抗腫瘤作用主要是由SAg依賴的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用(Supera antigen-dependented cellulartoxicity,SDCC)來完成。本實驗通過重組pSG218質(zhì)粒構(gòu)建攜帶超抗原葡萄球菌腸
2、毒素A(SEA)基因的DC318-SEA溶瘤腺病毒載體,加以鑒定,并將其擴增純化,以便構(gòu)建出具有潛在抗膀胱腫瘤作用的溶瘤腺病毒。
方法:1.攜帶超抗原SEA基因的重組質(zhì)粒pDC318-SEA的構(gòu)建、鑒定:將溶瘤腺病毒載體pSG218和超抗原SEA基因PCR擴增片段經(jīng)限制性內(nèi)切酶SpeⅠ和SalⅠ雙酶切后,12℃連接12 h。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化JM109大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞,鋪瓊脂板(含AMP)后,37℃生化培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)10~12
3、 h。挑取生長的細(xì)菌單克隆,在含氨芐青霉素的LB溶液中,37℃搖床擴增12 h。抽提陽性克隆的質(zhì)粒DNA,酶切鑒定及PCR鑒定正確后命名為pDC318-SEA。
2.溶瘤腺病毒DC318-SEA的重組及鑒定:將質(zhì)粒pDC318-SEA與病毒骨架質(zhì)粒pPE3-ccdB共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞,在其內(nèi)同源重組,9~14d出現(xiàn)病毒空斑,應(yīng)用QIAampDNABlood Mini Kit提取腺病毒DNA,應(yīng)用PCR進行鑒定。經(jīng)鑒定正
4、確的重組腺病毒命名為DC318-SEA。
3.重組溶瘤腺病毒的擴增、純化和滴度測定:首次擴增的病毒保存液加入HEK293細(xì)胞培養(yǎng)72 h,收集細(xì)胞反復(fù)凍融離心3次,收集上清反復(fù)擴增至需要病毒量。用氯化銫密度梯度超速離心法純化,用空斑實驗法測定病毒滴度。
結(jié)果:1.攜帶超抗原SEA基因的重組質(zhì)粒pDC318-SEA的鑒定:用SEA引物擴增pDC318-SEA載體,可以看到大小為774 bp的SEA基因片段;Sp
5、eⅠ+SalⅠ和ClaⅠ+HincⅡ?qū)DC318-SEA進行雙酶切后,可以看到768 bp的SEA基因片段+3888 bp大小的pSG218質(zhì)粒片段和大小為2325bp+1995bp+354bp大小片段,表明pDC318-SEA中已含有SEA基因片段。
2.攜帶超抗原SEA基因的溶瘤腺病毒DC318-SEA的PCR鑒定:提取病毒DNA,用SEA引物做PCR鑒定,擴增出774 bp片段,說明DC318-SEA可以表達SEA
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