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簡介：目的干細胞是一種能夠高度自我增殖、未充分分化不成熟的、具有再生為各種組織器官的細胞，醫(yī)學界稱為“萬用細胞”，隨著醫(yī)學研究不斷深入，干細胞移植治療已經成為解決許多疑難雜癥的首要治療方式。人臍帶間充質干細胞作為臍帶來源的成體干細胞，具有來源方便、增殖迅速、存活時間長、不受倫理與道德約束等特點，是細胞替代治療的理想來源。我們前期實驗研究了人臍帶間充質干細胞向生殖細胞、心肌細胞、神經細胞、癌細胞等細胞方向的誘導分化，但是對人臍帶間充質干細胞（HUMSCS）本身的分子調節(jié)機制暫未有具體的研究。ETV5作為ETS家族轉錄因子的一員，文獻報道ETV5在精原干細胞中能夠調控BCL6B、LHX1、CXCR4的表達及癌細胞中調控FOXM1的表達而參與細胞增殖、細胞自我更新、腫瘤形成等過程，所以本實驗旨在前期研究的基礎上，通過電轉染方式將ETV5SIRNA轉染HUMSCS，研究并探討ETV5在HUMSCS的生物學功能及其可能的調控機制。方法通過小塊組織貼壁法培養(yǎng)、擴增HUMSCS，取第三代的HUMSCS，消化、計數(shù)后通過電轉染方式以每孔4105細胞加3UM濃度的ETV5干擾RNA（SIRNA）將其轉染HUMSCS并接種到6孔板中，電轉染了ETV5SIRNA的HUMSCS為實驗組，僅單純電處理的HUMSCS為對照組，培養(yǎng)箱培養(yǎng)48H后顯微鏡下觀察細胞生長融合度、消化計數(shù)并提取RNA，采用QRTPCR檢測HUMSCS的ETV5MRNA表達情況；QRTPCR檢測BCL6B、LHX1、CXCR4、FOXM1MRNA的表達情況。結果顯微鏡下觀察電轉染了ETV5SIRNA的HUMSCS培養(yǎng)48H后細胞生長融合度約65％70，細胞計數(shù)平均約8105，對照組顯微鏡下觀察細胞生長融合度約80?，細胞計數(shù)平均約105105，差異具有統(tǒng)計學意義（P結論⑴HUMSCS通過電轉染ETV5SIRNA干擾ETV5表達，能抑制細胞增殖，說明ETV5在HUMSCS中能促進細胞增殖。⑵在HUMSCS中，隨著ETV5MRNA表達下降，BCL6B、FOXM1MRNA表達水平也下降，而CXCR4、LHX1MRNA表達水平升高。⑶在HUMSCS中，ETV5可能通過上調BCL6B、FOXM1表達而促細胞增殖，而通過負性調控CXCR4、LHX1的表達參與細胞的增殖、自我更新和細胞遷移。

簡介：學號201320120廣西醫(yī)科大學碩士學位論文兩種樹脂基質復合材料對人牙齦成纖維細胞生物學行為的影響江新葵導師姓名馮青專業(yè)名稱口腔臨床醫(yī)學申請學位類型學術型學位答辯委員會主席鄧旭亮答辯委員會委員程輝趙克莫水學廖紅兵二○一六年五月兩種樹脂基質復合材料對人牙齦成纖維細胞生物學行為的影響2013級碩士畢業(yè)論文簡歷基本情況姓名江新葵性別男民族瑤族出生年月198905籍貫廣西荔浦政治面貌中共黨員學習工作經歷200809201306廣西醫(yī)科大學本科學生201309201606廣西醫(yī)科大學碩士學生研究生期間科研經歷201309201402HU308藥物緩釋涂層對骨質疏松大鼠種植體周圍骨組織影響的實驗研究201503201604兩種樹脂基質復合材料對人牙齦成纖維細胞生物學行為影響的實驗研究

簡介：目的先天性心臟病CONGENITALHEARTDEFECT，CHD是最常見的嬰幼兒先天畸形，發(fā)病率約為1％～2％，也是嬰幼兒非感染性疾病死亡的最主要原因。由于缺乏特異性早期診斷方法和治療策略相對單一且風險大，鑒定CHD相關易感基因并闡明其作用機理和調控機制，將具有重要的理論和實踐意義。心臟發(fā)育依賴于不同類型細胞（如心肌細胞、心內膜細胞、心臟神經嵴細胞）的遷移、分化、增殖和凋亡，涉及各種轉錄因子、細胞黏附分子、信號分子所構成的精確而復雜的調控網絡。上述相關因素的改變將導致心臟異常發(fā)育而表現(xiàn)為CHD。DICER1基因定位于14Q3213，編碼一種具有1922個氨基酸殘基的核糖核酸酶。DICER1酶能夠識別具有莖環(huán)結構的單鏈前體MIRNAPRECURSMIRNA，PREMIRNA或雙鏈RNA（DOUBLESTRRNA，DSRNA），并將其切割成21～23NT的成熟MIRNA或SIRNA。DICER1基因表達異常與腫瘤、多發(fā)性硬化癥、突發(fā)性聽力喪失等疾病密切相關。DICER1基因條件性敲除小鼠表現(xiàn)出心臟畸形，但關于DICER1基因在心臟發(fā)育過程中的具體作用機理及其調控機制尚不清楚。NFATC3NUCLEARFACTOFACTIVATEDTCELLSC3，NFATC3基因定位于16Q222，編碼產物NFATC3蛋白作為轉錄因子，可以與靶基因調控序列中NFATC3結合位點（一致序列為GGAAA）結合，調控靶基因的表達。動物實驗提示NFATC3基因參與正常心臟發(fā)育過程。應用生物信息學軟件，我們在DICER1基因啟動子區(qū)預測到轉錄因子NFATC3結合位點。我們推測，NFATC3基因可能調控DICER1基因參與正常心臟發(fā)育。因此，本研究首先通過檢測DICER1SHRNA對大鼠心肌細胞H9C2生物學特性的影響，明確DICER1基因表達降低導致心臟畸形的可能作用機理其次通過染色質免疫沉淀（CHROMATINIMMUNOPRECIPITATION，CHIP）、螢光素酶報告系統(tǒng)、RNA干擾（RNAINTERFERENCE，RNAI）等功能研究，闡明NFATC3基因對DICER1基因的調控作用及其對大鼠心肌細胞H9C2生物學特性的影響，為揭示DICER1基因及其調控基因NFATC3在心臟發(fā)育過程中的作用提供理論依據(jù)。方法一、實驗材料1、細胞株大鼠心肌細胞H9C22、組織標本10例心肌組織標本由中國醫(yī)科大學盛京醫(yī)院提供，標本采集均已簽署知情同意書，并經醫(yī)學倫理委員會審查批準通過。二、實驗方法1、DICER1基因RNA干擾實驗DICER1SHRNA轉染大鼠心肌細胞H9C2，REALTIMEPCR和WESTERNBLOT檢測DICER1基因表達。2、DICER1SHRNA對大鼠心肌細胞H9C2生物學特性的影響CCK8活細胞染色法檢測細胞增殖率，WESTERNBLOT分析PCNA表達水平PI單染法測定細胞周期，WESTERNBLOT分析CYCLINE1和CYCLINA表達水平ANNEXINⅤAPCPI方法檢測細胞凋亡，WESTERNBLOT分析CASPASE3表達水平。3、DICER1基因啟動子區(qū)NFATC3結合位點的鑒定生物信息學軟件預測DICER1基因啟動子區(qū)NFATC3結合位點，CHIP實驗鑒定NFATC3與DICER1基因啟動子區(qū)NFATC3結合位點的特異性結合共轉染NFATC3SIRNA和DICER1基因啟動子區(qū)螢光素酶重組載體PDICER1，應用螢光素酶活性檢測系統(tǒng)分析螢光素酶活性，驗證NFATC3與DICER1基因啟動子區(qū)特異性結合。4、心肌組織NFATC3基因、DICER1基因表達分析在10例心肌組織中，WESTERNBLOT檢測NFATC3蛋白表達，REALTIMEPCR檢測DICER1MRNA表達，并進行相關性分析。5、NFATC3基因RNA干擾實驗NFATC3SIRNA轉染大鼠心肌細胞H9C2，WESTERNBLOT檢測NFATC3蛋白表達，REALTIMEPCR和WESTERNBLOT分析DICER1基因表達水平。6、NFATC3SIRNA對大鼠心肌細胞H9C2生物學特性的影響CCK8活細胞染色法檢測細胞增殖率，WESTERNBLOT分析PCNA表達水平PI單染法測定細胞周期，WESTERNBLOT分析CYCLINE1和CYCLINA表達水平ANNEXINⅤFITCPI方法檢測細胞凋亡。結果1、DICER1SHRNA能夠有效抑制DICER1基因表達與轉染NEGATIVECONTROL相比，轉染DICER1SHRNA3D后，DICER1基因MRNA和蛋白表達水平分別下降79％和54％P＜005。2、DICER1基因表達降低能夠抑制心肌細胞增殖與轉染NEGATIVECONTROL相比，轉染DICER1SHRNA3D后，活細胞數(shù)顯著減少，細胞增殖抑制率為3186±002％，PCNA表達降低31％P＜005。3、DICER1基因表達降低使細胞周期重新分布，阻滯于S期與轉染NEGATIVECONTROL相比，轉染DICER1SHRNA4D后，G1期細胞數(shù)顯著減少，所占百分比為6321±282％P＜005，而S期細胞數(shù)顯著增多，所占百分比為2122±60％，CYCLINE1表達升高35％，CYCLINA表達降低32％P＜005。4、DICER1基因表達降低能夠促進心肌細胞凋亡與轉染NEGATIVECONTROL相比，轉染DICER1SHRNA4D后，心肌細胞凋亡指數(shù)為1304±30％，CASPASE3表達升高16％P＜005。5、NFATC3能夠與DICER1基因啟動子區(qū)NFATC3結合位點特異性結合生物信息學軟件在DICER1基因啟動子區(qū)預測到3個潛在的NFATC3結合位點，CHIP實驗在體內鑒定NFATC3能夠與DICER1基因啟動子區(qū)476～472BP處NFATC3結合位點特異性結合螢光素酶報告系統(tǒng)證明轉錄因子NFATC3可與DICER1基因啟動子區(qū)特異性結合并影響DICER1基因轉錄活性。6、心肌組織中NFATC3基因與DICER1基因表達呈正相關NFATC3蛋白和DICER1MRNA的表達呈顯著正相關R067，P＜005。7、NFATC3基因正調控內源性DICER1基因表達與轉染NEGATIVECONTROL相比，轉染NFATC3SIRNA2D后，NFATC3蛋白表達水平下降73％P＜005，DICER1基因MRNA和蛋白表達水平分別下降64％和49％（P＜005）。8、NFATC3基因表達降低能夠抑制心肌細胞增殖與轉染NEGATIVECONTROL相比，轉染NFATC3SIRNA3D后，細胞增殖抑制率為1586±002％，PCNA表達降低29％P＜005。9、NFATC3基因表達降低使細胞周期重新分布，阻滯于S期與轉染NEGATIVECONTROL相比，轉染NFATC3SIRNA3D后，G1期細胞數(shù)顯著減少，所占百分比為5380±46％P＜005，而S期細胞數(shù)顯著增多，所占百分比為3010±410％，CYCLINE1表達升高15％，CYCLINA表達降低21％P＜005。10、NFATC3基因表達降低不影響心肌細胞凋亡與轉染NEGATIVECONTROL相比，轉染NFATC3SIRNA3D后，心肌細胞凋亡指數(shù)為037±012％P＞005。結論1、DICER1基因表達降低能夠促進心肌細胞凋亡，抑制心肌細胞增殖，使細胞周期重新分布、阻滯于S期。2、NFATC3基因表達降低能夠抑制心肌細胞增殖，使細胞周期重新分布、阻滯于S期。3、NFATC3基因靶向正調控DICER1基因表達。

簡介：流體黏性的檢測在生物醫(yī)學，化學，材料等領域應用廣泛。例如，在醫(yī)學領域，基礎及臨床研究顯示體液黏性與許多疾病密切相關心腦血管病患者與正常人相比，血液表觀黏度有顯著的變化；退行性關節(jié)病，風濕性關節(jié)炎病引起關節(jié)滑膜液的黏性改變等。目前許多研究涉及到各種類型的生物體液，例如小型動物體液獲取困難，代價很高，降低黏性檢測中的樣品消耗尤為重要。另一方面，黏度也可能影響到腫瘤細胞的黏附行為。黏度是微粒分散體系中粒子的沉降速率的決定因素之一，對于多相流體，當微粒的密度大于分散介質的密度，就會發(fā)生沉降，根據(jù)STOKES定律，黏度越大，沉降速度越小，懸浮液中的粒子越穩(wěn)定，越不易發(fā)生沉降。而腫瘤細胞在血管壁的黏附可以簡化成一個粒子在血液中沉降與管壁接觸黏附的過程，在這一過程中，黏度可能影響到血流中接觸到管壁的腫瘤細胞數(shù)，因此，黏度對腫瘤細胞黏附行為的影響是值得考察的。此外，由于微流控裝置具備微型化、集成化的優(yōu)勢，近年來被廣泛應用在生物技術，化學化工等領域。如何在微小的芯片內精確地掌控流體的運動形態(tài)是微流控技術的最為基礎而重要的一環(huán)。而黏度，作為一項基本的流變學參數(shù)，對分析流體的運動行為是極為關鍵的。因此，為了滿足微流控實驗微量化的樣品需求，高效的測量實驗所涉及的流體黏度便成為現(xiàn)代黏性測量技術的主要課題之一。然而，現(xiàn)有微試樣黏度計的研究面臨著一些瓶頸（1）由于尺度的縮小，末端效應、表面張力等在宏觀尺度下可忽略的效應陡然增大，并導致了顯著的誤差。這使得現(xiàn)有微試樣黏度計的測量準確度普通較低，尤其是在低剪切率的條件下測量低黏度的樣品時這一問題尤為突出（誤差5％24）。（2）盡管現(xiàn)有的微試樣黏度計芯片本身樣品容積量很小，但為了驅動流體進行檢測，需要連接容積量很大的泵和導管，因此總的樣品消耗量仍然居高不下。（3）同樣由于尺度的縮小，通道的表面粗糙度過大會給流動造成明顯的擾動導致宏觀流體力學的失效。因此，微試樣黏度計的制作需要嚴格控制通道的表面粗糙度，要求更為嚴格的制作工藝，這使得系統(tǒng)搭建及制作成本很高。（4）由于芯片體積小樣品少，熱容量小，對環(huán)境溫度變化特別敏感，這對測量環(huán)境的溫度控制提出了更嚴格的要求。而現(xiàn)有的微試樣黏度計未能很好地解決這一問題。基于上述原因，現(xiàn)有的微試樣黏度計一直未能得到商業(yè)化的運用。因此，提供更加精確、穩(wěn)定、微試樣的黏性測量方法，為科研工作者提供可靠的流體黏度數(shù)據(jù)，是論文所需完成的主要目標。本文提出了一種高效、精確、微試樣低成本的微流控黏性檢測芯片（后簡稱為芯片黏度計），可以用于生物類流體的黏度測量。在對末端效應、表面張力、動能修正項等引入的誤差進行評估后，研究者對芯片的構型及尺寸進行了優(yōu)化通道的兩端加入了一對匹配的光滑圓管，幾乎完全避免了表面張力的影響。芯片的尺寸通過誤差分析決定，優(yōu)化后的芯片誤差被嚴格控制在05以下，且每次測量消耗量僅為200ΜL。本文采用自制的配套模具，結合抽絲法，能夠輕易地在芯片內部形成表面光滑的圓管，適應了通道表面粗糙度需要嚴格控制的加工需求。為了保證測量環(huán)境的溫度恒定，本文為芯片黏度計設計了一套專門的測量平臺。測試時，芯片置于特制的恒溫水浴槽中，樣本流體加載于芯片的上游儲液池中，被外部壓力控制裝置驅動，樣品通過主通道后流入到下游儲液池中。測試流體在黏度測量芯片內的流動狀態(tài)通過CCD對儲液池的液面流動情況進行記錄，并利用一段圖像處理程序對視頻進行處理。通過程序自動提取運動軌跡信息、自動輸出黏度值，不但使操作更簡單，又減少了人為因素引入的誤差，使測量結果具有良好的復現(xiàn)性。相較于其他微試樣黏度計，本文研制的芯片黏度計結果更加準確通過將本文所研制的芯片黏度計與美國國家標準局（NIST）公布的參考值，傳統(tǒng)毛細管黏度計，傳統(tǒng)旋轉黏度計進行橫向比對，可以看出芯片黏度計的測量結果與標準值、傳統(tǒng)烏氏黏度計測量值三者吻合良好，相對誤差小于2。本文還根據(jù)國際標準化組織以及國際電工委員會（ISOIEC）發(fā)布的測量不確定度評估指南對芯片黏度計進行完整的不確定度評估，計算其擴展相對不確定度U9522，較主流的微試樣黏度芯片準確度提高了2倍以上。在芯片黏度計制作完成后，本論文為了考察黏度與腫瘤細胞黏附行為的關系，本文還設計構建了一個理想化的HEPG2細胞黏附模型，用于模擬腫瘤細胞在人體血管環(huán)境里的黏附行為。在此模型中，本文綜合考慮了黏度、流場等力學因子對腫瘤細胞黏附行為產生的影響。首先，本文通過有限元分析預測了芯片模型中的流場、紊流分布強度等信息，在此基礎上，我們通過三組對比實驗考察了黏度、細胞密度以及它們與流場之間的相互作用對芯片底面HEPG2細胞黏附數(shù)量產生的影響。研究結果表明，當血管分岔角增大時，紊流強度也增大。流場中紊流的增加能有效的提高芯片底面黏附的HEPG2細胞數(shù)量，但黏附細胞的總數(shù)受芯片底部管壁容納極限的影響，因此紊流強度達到一定程度后，黏附細胞數(shù)逐漸趨于穩(wěn)定不再繼續(xù)增大。增加細胞密度相當于增加細胞與底面接觸的幾率，也能起到增加底面黏附細胞數(shù)的效果，其作用效果在低紊流環(huán)境下格外顯著。而流體黏度對底面黏附細胞數(shù)的影響較為復雜，對于不同紊流環(huán)境其效果相差較大，一方面黏度增大了流動阻力，降低了HEPG2細胞的移動速度，增加了HEPG2細胞在底面黏附的可能性；另一方面，黏度的增加降低了HEPG2的沉降速度，更多的HEPG2懸浮在溶液中，不與管壁接觸。因此，在黏附能力較弱的低紊流環(huán)境下，這兩個因素互相抵消，黏附細胞數(shù)保持穩(wěn)定。而在黏附能力較強的高紊流環(huán)境里，后者的影響占主要，因此黏度增加，芯片底部的黏附細胞數(shù)大幅度降低。實驗結果與我們的預期吻合較好。本文所研制的芯片黏度計還具有樣品消耗量小，制造簡單，成本低廉，操作方便且易于維護的優(yōu)勢。它基于抽絲法構建，與傳統(tǒng)的軟蝕刻技術相比，不需要依賴各種昂貴設備和器材。僅利用微絲和自制的配套模具，將毛細管，儲液池，壓力接口全部整合于一塊芯片中，一方面大幅度的降低了制造成本，另一方面又避免了各部件的連接和密封不良可能導致的漏液，減少了連接部位產生的壓降損失從而降低了誤差。由于價格低廉，它可以作為一次性用品以避免芯片之間的樣品污染，也可以多次清洗重復使用進一步降低成本。本黏性測量芯片為微試樣生物流體的精確測量提供了一種新的途徑，可以在生物醫(yī)學、化學化工等領域代替烏氏黏度計執(zhí)行其無法完成的黏性測量，為芯片內流動分析、力學模擬及流動控制等提供精確可靠的流動參數(shù)，在生物醫(yī)學、化學化工、材料等領域具有廣闊的應用前景。

簡介：大連醫(yī)科大學碩士學位論文中圖分類號密級ELF4G1對非小細胞肺癌生物學功能影響的研究FUNCTIONALROLEOFEUKARYOTICTRANSLATIONINITIATIONFACTOR4GAMMA1EIF4G1INNSCLC曹月譽目幾置計學位論文51頁表格4個插圖16幅指導教師秦智強教授申請學位級別碩士學位學科專業(yè)生物化學與分子生物學培養(yǎng)單位大連醫(yī)科大學研究生院完成時間二。一六年三月答辯委員會主席毒瓣關于學位論文使用授權的說明本學位論文作者完全了解學校有關保留、使用學位論文的規(guī)定，同意學校保留并向國家有關部門或機構送交論文的復印件和電子版，允許論文被查閱和借閱。本人授權大連醫(yī)科大學可以將本學位論文的全部或部分內容編入有關數(shù)據(jù)庫進行檢索，可以采用影印、縮印或掃描等復制手段保存和匯編本學位論文。本學位論文屬于請在以下相應方框內打“、／’’1保密口，在年解密后適用本授權書。2不保密口。作者簽名＼耪】；L瓠導師簽名磊澆‰|～日期弘F‘年5月26日日期五心年5月磊日

簡介：背景自從間充質干細胞于1966年被FRIEDENSTEIN從骨髓中發(fā)現(xiàn)開始越來越多的研究發(fā)現(xiàn)間充質干細胞在一定的條件下具有向內、中、外三個胚層分化的能力其中包括分化為骨細胞軟骨細胞、脂肪細胞、內皮細胞、肝細胞、心肌細胞等多種細胞的潛能可以廣泛參與組織器官損傷的修復過程成為組織工程和干細胞治療領域的研究熱點。其中骨髓來源的間充質干細胞BMSCS憑借易于培養(yǎng)擴增、遺傳背景相對穩(wěn)定且多向分化特性不受影響等特性被廣泛用于細胞及組織多種疾病的替代治療。但隨著對間充質干細胞研究的不斷深入發(fā)現(xiàn)成年動物骨髓源間充質干細胞數(shù)量及增殖、分化潛能隨年齡的增大而不斷下降且供者間充質干細胞的采集須行骨髓穿刺術由于疾病的原因病人常有感染、體質較弱等因素也限制了自體骨髓間充質干細胞移植的廣泛應用。因此尋找新的間充質干細胞來源是近年來國內外干細胞研究的熱點之一。1991年MCELREAVEY等首次報道從人臍帶的WJ組織中分離并培養(yǎng)到了一種成纖維樣細胞具有較高的分化潛能。隨后數(shù)位研究者也分別報道從WJ中分離到豐富的MSCS。通過大量體外誘導實驗證實特定條件下其同樣具有成骨、成軟骨、成脂肪、成肌肉、成血管內皮、成神經細胞等多向分化能力通過和其他來源MSCS特別是和作為MSCS金標準的BMSCS相比臍帶間充質干細胞具有巨大優(yōu)勢首先來源廣泛取材方便供者無痛苦；其次相對純凈污染機會少；第三含量豐富較為原始增殖分化能力強免疫原性低生物性能穩(wěn)定可以為實驗和臨床提供充足的細胞來源。因此臍帶間充質干細胞有望成為骨髓間充質干細胞的理想替代來源成為近來基礎研究與臨床廣泛研究的熱點?？蒲腥藛T和公眾均寄希望通過間充質干細胞領域的研究治愈諸如難愈性創(chuàng)面多臟器損傷心肌梗死等傳統(tǒng)方式治療效果欠佳的疾病。盡管目前間充質干細胞治療在臨床上的效果尚未得到完全確證還是有越來越多的國家正加入此項研究。然而間充質干細胞治療要想真正從實驗室走向臨床應用還面臨著諸多挑戰(zhàn)尚有很多關鍵性問題亟待解決。特別是間充質干細胞體外的生物學特性研究至關重要是其臨床應用的基礎及前提。蛻皮甾酮EDS是一種調控昆蟲蛻皮過程的激素廣泛存在于眾多植物類群及動物類群中結構類似于雌二醇實驗證實其能夠有效促進哺乳動物的多種組織和器官的核酸與蛋白質的合成及糖和脂類代謝。由于該類物質來源廣泛生物學特性復雜因此吸引了許多學者投身其研究工作。OTAKA等報道羥基蛻皮甾酮無論體內還是體外實驗均可迅速刺激大鼠肝臟蛋白的合成。體外實驗中羥基蛻皮甾酮能夠通過促進合成進而增強微粒體和核糖體的蛋白合成能力。YOSHIDAT等報道了蛻皮甾酮對糖代謝的調節(jié)效應預先腹腔注射羥基蛻皮甾酮能夠對抗腹腔注射胰高血糖素及靜脈注射抗胰島素引起的高血糖癥。SYROVVN等報道蛻皮甾醇具有保護肝臟的作用。隨著研究的不斷深入蛻皮甾酮更多的生物學特性將被揭示出來。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)EDS具有促進人臍靜脈內皮細胞增殖促進創(chuàng)傷皮膚愈合促進表皮及骨髓間充質干細胞增殖等作用。最新研究表明特定條件下甾體類激素地塞米松具有誘導HUCMSCS分化為骨細胞并表達骨橋蛋白、涎蛋白、骨連接素等骨性標志物的能力且可在黏多糖的基質上形成類似于關節(jié)軟骨的球狀骨針可有效誘導間充質干細胞的成骨分化同屬甾體類物質的蛻皮甾酮表現(xiàn)出的生物多效性提示其對促臍帶間充質干細胞增殖及誘導分化等方面有一定的影響最新研究顯示間充質干細胞經誘導劑作用后可有效治療骨質疏松等疾病EDS能否誘導臍帶間充質干細胞成骨分化尚不明確進行此項研究具有廣闊的應用前景。目的分離培養(yǎng)并鑒定人臍帶間充質干細胞HUMANUMBILICALCDMESENCHYMALSTEMCELLSHUCMSCS為后續(xù)實驗提供充足的種子細胞。方法采用酶消化法及組織塊培養(yǎng)法分離出HUCMSCS通過培養(yǎng)、傳代擴增從而獲取相對均一、足夠數(shù)量的臍帶間充質干細胞。取第3代HUCMSCS通過細胞流式學檢測對臍帶間充質干細胞表面特異性標志CD29、CD34、CD44、CD45、CD90、CD105及多向分化能力加以鑒定。取第3、7代HUCMSCS繪制細胞生長曲線并觀察細胞形態(tài)學變化。結果1HUCMSCS的形態(tài)學觀察倒置顯微鏡下觀察酶消化法所得細胞原代接種24H可見有少量細胞貼壁外觀呈紡錘形和短棒形并可見細胞核。培養(yǎng)至5D左右細胞大部為雙突起的長梭形、扁平形生長核仁較前明顯。培養(yǎng)至10D左右細胞形態(tài)變?yōu)闉榈湫偷某衫w維細胞形態(tài)當細胞達到80％融合時予以消化、傳代。傳代培養(yǎng)至P3后可出現(xiàn)明顯的單一細胞集落。從原代培養(yǎng)來看膠原酶消化法比組織塊培養(yǎng)法的效率更高大約10D就可以進行傳代而組織塊培養(yǎng)法要14D才能傳代形態(tài)學變化及之后的傳代兩者之間沒有顯著性差別。2流式細胞學檢測CD34陽性率為754％CD45陽性率為535％CD29陽性率為9845％CD44陽性率為9783％CD90陽性率為9736％CD105陽性率為9920％3HUCMSCS體外多向誘導分化31HUCMSCS成骨誘導的形態(tài)變化及功能鑒定成骨誘導5D左右細胞形態(tài)逐漸由長梭形變?yōu)槿切位蚨嘟切蔚?。高倍顯微鏡下觀察可見細胞質內含顆粒樣物質。誘導10D細胞胞質中及胞質外均可見較多細小黑色顆粒胞核顏色較淡胞質色變深。3W時細胞生長密集中央可見類似結節(jié)狀的結構部分細胞呈現(xiàn)層疊樣生長。堿性磷酸酶及茜素紅染色顯示強陽性符合成骨細胞的特征。說明HUCMSCS在體外具有向成骨細胞分化的潛能。32HUCMSCS成脂誘導的形態(tài)變化及功能鑒定成脂誘導7D左右細胞形態(tài)逐漸由長梭形變?yōu)槎讨?；在誘導約14D時細胞變?yōu)闄E圓形、圓形；20D時胞質內可見脂滴形成油紅“O”染色呈強陽性。表明HUCMSCS在體外具有向脂肪細胞分化的潛能。4HUCMSCS生長曲線HUCMSCS生長曲線呈“S”形接種后第1～2天為潛伏適應期從第3天起細胞開始增殖并進入對數(shù)生長期第5天達到高峰7天以后進入平臺期。根據(jù)生長曲線可知HUCMSCS的群體倍增時間約為24H。增殖曲線顯示本實驗中P3、P7代細胞增殖速率無顯著差異。結論1HUCMSCS可通過酶消化法及組織塊培養(yǎng)法體外分離、純化培養(yǎng)細胞生長穩(wěn)定可連續(xù)傳代。組織塊培養(yǎng)法的原代培養(yǎng)時間為14～16D培養(yǎng)時間較長而采用膠原酶消化法可快速獲得大量貼壁生長的MSCS且操作簡便易行可更好地保持細胞活力大大縮短了原代培養(yǎng)時間。2經流式紐胞儀檢測HUCMSCS均一地高表達間質細胞標志CD29、CD44、CD90、CD105陰性表達造血系標志CD34、CD45本實驗結果表明HUCMSCS與其他組織來源的MSCS流式檢測表型一致。3經成骨和成脂誘導培養(yǎng)基誘導后通過ALP染色以及茜素紅染色證實分化為成骨細胞通過油紅“O”染色證實分化為脂肪細胞實驗證實分離所得HUCMSCS具有多向分化能力。4HUCMSCS隨著傳代次數(shù)增加增殖能力未見顯著降低。目的觀察凍存復蘇后人臍帶間充質干細胞HUMANUMBILICALCDMESENCHYMALSTEMCELLSHUCMSCS的復蘇率及增值活性探討液氮長期保存間充質細胞的可行性。方法參照前面方法體外分離培養(yǎng)獲得原代人臍帶間充質干細胞采用改良分階段凍存方法5個月后復蘇細胞培養(yǎng)觀察比較各實驗組細胞成活率和MTT法檢測細胞增值能力的差異流式細胞儀檢測凍存細胞的表型變化。結果1復蘇HUCMSCS的形態(tài)學特征。復蘇后細胞2H即開始貼壁逐漸轉變?yōu)樗笮渭岸嘟切?。復蘇細胞一周左右即可傳代傳至第3代時細胞形態(tài)與正常培養(yǎng)對照組無明顯差別。2流式細胞檢測復蘇HUCMSCS符合間充質干細胞的表型特征。MTT法檢測顯示低溫凍存并沒有降低間充質干細胞增殖活性。結論通過檢測凍存復蘇細胞的存活率臍帶間充質干細胞表面標志未發(fā)生改變表明液氮凍存法可長期保存間充質干細胞；另外恰當選擇對數(shù)生長期的細胞凍存且凍存細胞濃度應達到1106ML對于保證凍存成功同樣起著關鍵作用。目的觀察蛻皮甾酮ECDYSTERONEEDS對人臍帶間充質干細胞HUMANUMBILICALCDMESENCHYMALSTEMCELLSHUCMSCS體外增殖的影響并探討其促進細胞增殖的可能機制。方法取第3代HUCMSCS分別在基礎培養(yǎng)基低糖DMEM培養(yǎng)基、10％的胎牛血清、100UM青鏈霉素、4MMOLLL谷氨酰胺中加入不同濃度0、25、50、100、150、200ΜGMLEDS予以干預分別于第1、3、5、7天行MTT法檢測細胞增殖活性；另外設置相同分組EDS干預培養(yǎng)HUCMSCS7天繪制細胞生長曲線觀察比較細胞增殖差異。經細胞流式儀測定不同分組細胞周期觀察增殖期細胞所占比例。對數(shù)據(jù)行統(tǒng)計學處理。結果1、MTT法檢測結果顯示經EDS干預培養(yǎng)的HUCMSCS增殖能力較空白對照組有顯著差異P＜005其中EDS100ΜGML、150ΜGML及200ΜGML三組細胞活性比較無顯著差異P＞005較其他實驗組有統(tǒng)計學意義P＜005。2、細胞生長曲線同樣顯示EDS實驗組可有效促進間充質干細胞的增殖。其中EDS100ΜGML實驗組促增殖效果最明顯EDS100ΜGML、150ΜGML及200ΜGML三組未見顯著性差異。3、流式細胞儀測定各組細胞周期顯示EDS100ΜGML、150ΜGML及200ΜGML三組細胞S期細胞所占比例最大與其他實驗組比較有顯著差異同時三組細胞的增殖指數(shù)也顯著高于對照組。結論本實驗證實體外條件下EDS在一定濃度范圍內具有促進HUCMSCS增殖的作用該作用具有一定的濃度依賴性當EDS濃度為100ΜGML促增殖作用達到最佳效果初步機制認為EDS主要是通過改變細胞周期促進細胞增殖。目的觀察蛻皮甾酮ECDYSTERONEEDS對人臍帶間充質干細胞HUMANUMBILICALCDMESENCHYMALSTEMCELLSHUCMSCS成骨分化的影響。方法人臍帶間充質干細胞的分離、培養(yǎng)鑒定取第5代臍帶間充質干細胞分別在基礎誘導培養(yǎng)基中加入不同濃度EDS和地塞米松予以干預分別于第1、3、5、7天MTT法檢測細胞增殖率；另外設置相同的分組誘導培養(yǎng)4周后行茜素紅及堿性磷酸酶鈣鈷法染色鑒定細胞成骨分化能力計算陽性細胞百分比。結果1MTT檢測顯示一定范圍內EDS在基礎誘導培養(yǎng)基中具有促進細胞增殖的作用濃度增高至200ΜGML對細胞表現(xiàn)抑制作用地塞米松對細胞增殖有抑制作用。2茜素紅及堿性磷酸酶鈣鈷法染色鑒定顯示基礎誘導培養(yǎng)組細胞染色陰性EDS及地塞米松組實驗組均可以誘導HUCMSCS鈣化結節(jié)形成比較發(fā)現(xiàn)EDS200ΜGML組細胞陽性率與經典誘導組無顯著差異P＞005EDS200ΜGML組與經典誘導組成骨細胞陽性率均顯著高于EDS100ΜGML組P＜001。結論EDS在濃度200ΜGML時具有誘導HUCMSCS成骨分化的作用但對細胞增殖抑制作用顯著。初步認為EDS通過雌激素受體發(fā)揮此作用。EDS200ΜGML組較EDS100ΜGML組成骨作用差異顯著表明誘導成骨作用具有一定的濃度依賴性。

簡介：碩士學位論文槐耳清膏對人肺腺癌細胞生物學行為的影響槐耳清膏對人肺腺癌細胞生物學行為的影響及分子機制研究及分子機制研究專業(yè)名稱病理學與病理生理學專業(yè)代碼100104培養(yǎng)類型學術學位論文編號21400156獨創(chuàng)性聲明獨創(chuàng)性聲明本人鄭重聲明所呈交的學位論文是本人在指導教師指導下進行的研究工作及所取得的研究成果。除了文中特別加以標注和致謝的地方外，論文中不包含其它人已經發(fā)表或撰寫過的研究成果，也不包含為獲得大連醫(yī)科大學或其它教育機構的學位或證書而使用過的材料。與我一同工作的同志對本研究所做的任何貢獻均已在論文中作了明確的說明并表示謝意。學位論文作者簽名簽字日期年月日

簡介：南開大學博士學位論文細胞色素P450酶系統(tǒng)電子傳遞及底物作用機制的結構生物學研究姓名楊文申請學位級別博士專業(yè)生物化學與分子生物學指導教師饒子和201011中文摘要突變造成329位脯氨酸被強行擠入原底物結合通道從而有效限制了活性中心的大小，使得該突變體增強了對非天然小分子底物的催化能力。1401P突變體則在結構上表現(xiàn)出了許多該野生型蛋白在底物結合狀態(tài)下所具有的特征提供血紅素鐵原子第六配位鍵水分子的異常；近血紅素一側的LOOP遠離活性口袋；I螺旋處殘基265位甘氨酸和266位組氨酸構象變化導致的螺旋內部氫鍵的斷裂。這種近似底物結合狀態(tài)下的構象為原始底物長鏈飽和脂肪酸的催化提供了極為便利的條件。本論文的研究工作有助于深入理解細胞色素P450酶系統(tǒng)電子傳遞蛋白相互識別的特異性，小分子底物識別進入酶蛋白活性中心的途徑，以及酶蛋白突變體功能和結構的關系，并為這三方面的進一步研究奠定了堅實的基礎。關鍵詞細胞色素P450；I類型電子傳遞系統(tǒng)；底物進入通道；多步結合機制；定向進化；晶體結構Ⅱ

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簡介：分類號分類號R7337密級密級公開公開研究生學位論文論文題目（中文）論文題目（中文）X射線對肺腺癌射線對肺腺癌A549細胞生物學特性的作用細胞生物學特性的作用論文題目（外文）論文題目（外文）THESTUDYONBIOLOGICALEFFECTSOFLUNGADENOCARCINOMAA549CELLSWITHXRAYSIRRADIATION研究生姓名研究生姓名楊震學科、專業(yè)學科、專業(yè)生物科學生物科學細胞生物學細胞生物學研究方研究方向醫(yī)學與腫瘤細胞生物學醫(yī)學與腫瘤細胞生物學學位級別學位級別碩士導師姓名、職稱導師姓名、職稱王小虎王小虎教授教授論文工作論文工作起止年月起止年月2013年11月至月至2016年6月論文提交日期論文提交日期2016年5月論文答辯日期論文答辯日期2016年5月學位授予日期學位授予日期2016年6月校址甘肅省蘭州市校址甘肅省蘭州市蘭州大學碩士學位論文X射線對肺腺癌A549細胞生物學特性的作用IX射線對肺腺癌射線對肺腺癌A549細胞生物學特性的作用細胞生物學特性的作用中文摘要中文摘要目的目的本文主要用0、05、1、2、4和10GY不同劑量的X射線輻照肺腺癌A549細胞后，研究A549細胞的凋亡率、粘附性、遷移和侵襲的生物學特性，初步探討X射線對MMP2MRNA、MMP9MRNA及兩種蛋白表達水平變化與腫瘤細胞轉移的可能機制。方法方法肺腺癌A549細胞經過不同劑量的X射線輻照后，在不同的時間段用流式細胞儀檢測細胞凋亡率的變化；選用MTS法檢測A549細胞粘性變化；用TRANSWELL小室檢測X射線對A549細胞遷移和侵襲的影響變化；提取細胞中MRNA和總蛋白，用熒光定量PCR法和WESTERNBLOTING檢測MMP2MRNA、最后MMP9MRNA和兩種蛋白的表達水平的變化。結果結果不同劑量的X射線輻照A549細胞后，細胞凋亡率隨著輻照劑量增加而相應增多，并且在一定時間內隨著輻照后時間的延長，凋亡數(shù)也相應增加，與輻照劑量和輻照后時間呈相關性（P＜005）。細胞粘附能力隨著輻照劑量的增加而增強，與對照組0GY相比，有統(tǒng)計學意義（P＜005）。遷移試驗結果表明，在05、1和2GY輻照后，與對照組0GY相比，細胞遷移率無顯著性差異沒有統(tǒng)計學意義（P＞005）隨著輻照劑量的增加，在4和10GY時，與對照組0GY相比，細胞遷移數(shù)顯著下降，有統(tǒng)計學意義（P＜005）；細胞侵襲實驗結果與遷移基本一致。熒光定量（RTPCR）實驗結果發(fā)現(xiàn)，在05、1和2GY的劑量輻照后，與對照組0GY相比，MMP2MRNA、MMP9MRNA表達量量無顯著差異（P＞005），在4和10GY輻照后，于對照組0GY相比，MMP2MRNA和MMP9MRNA表達量顯著下降，有統(tǒng)計學意義（P＜005）。WESTERNBLOTING檢測發(fā)現(xiàn)，在05、1和2GY射線輻照后，與對照組0GY相比，MMP2和MMP9蛋白表達量變化無顯著差異（P＞005）；輻照劑量增加到4和10GY時，兩種蛋白表達量與對照組0GY相比有顯著性差異，具有統(tǒng)計學意義（P＜005）。結論結論肺腺癌A549細胞經過不同劑量的X射線輻照后，細胞凋亡率與輻照劑量和輻照后培養(yǎng)的時間具有依賴性關系；不同劑量的X射線在一定的輻照范圍內，

簡介：目的急性肺損傷和急性呼吸窘迫綜合癥ALIARDS是各種致病因素導致的急性進行性呼吸衰竭是臨床常見急重癥其死亡率在20世紀70年代早期高達70％以上盡管近年來對其認識及救治技術不斷提高但總體病死率仍然在40％以上。國內外學者對ARDS的治療進行了大量研究并取得了一些進展但相關治療策略均只能在一定程度上緩解病情并不能從根本上改善ARDS的不良預后。炎癥反應介導的肺毛細血管內皮細胞與肺泡上皮細胞損傷是ARDS的特征性病理改變因此對受損肺臟進行結構修復和功能重建才是降低ARDS死亡率的理想治療方式成體干細胞具有多向或單向分化潛能取材方便易于分離擴增并且不涉及到醫(yī)學倫理學的相關問題因而在ALIARDS治療中具有重要的應用價值。內皮祖細胞EPC是血管內皮細胞的前體細胞并且可參與出生后血管新生、再內皮化和內皮損傷后的修復。鑒于EPC作為內源性修復機制在維持內皮細胞層完整性方面發(fā)揮了重要的作用并且內皮受損為ARDS早期的特征性病理改變之一因此EPC移植有希望成為ALIARDS的有效治療手段。本研究旨在了解ARDS動物模型不同發(fā)病階段EPC的動態(tài)變化規(guī)律觀察EPC自體移植以及EPC培養(yǎng)液“無細胞移植”對ARDS的生物作用并探討其可能的作用機制為提出ALIARDS治療新方法提供實驗線索。方法⑴從兔耳中央動脈抽取外周血10MLKG以密度梯度法分離出單個核細胞PMC并將其接種于培養(yǎng)皿內；使用添加了細胞因子和胎牛血清的內皮祖細胞專用培養(yǎng)液EGM2進行誘導分化培養(yǎng)。首次換液時間為72小時其后每48小時換液一次。結果顯示體外培養(yǎng)24小時后可見到單個核細胞粘附于培養(yǎng)皿底部。粘在第3天時部分細胞呈現(xiàn)出紡錘形變化并且細胞分裂增殖明顯。此時更換培養(yǎng)液以除去未貼壁細胞和紅細胞。從第5天起一部分單核細胞轉化為梭形的貼壁細胞并且隨著體外培養(yǎng)時間的延長圓形細胞的數(shù)量逐漸減少而梭形細胞的數(shù)量逐漸增多在第7天左右可觀察到成團細胞形成的細胞集落。在第14天左右細胞形狀變?yōu)殚L梭形并且多角形細胞有融合趨勢吞噬功能和粘附功能實驗顯示體外培養(yǎng)的EPC可同時攝取DIL標記的乙?；兔芏戎鞍譊ILACLDL并粘附FITC標記的荊豆凝集素1FITCUEA1熒光顯微鏡下雙陽性細胞的比率接近100％通過免疫熒光對表面標志物進行檢測顯示95％以上的細胞同時表達血管內皮生長因子受體2VEGFR2和CD34。依據(jù)上述條件可認定通過密度梯度離心后體外培養(yǎng)擴增的細胞為早期EPC。⑵通過耳緣靜脈將內毒素ET055B5；500ΜGKG和700ΜGKG注入新西蘭大白兔體循環(huán)內72小時后活殺各組動物并取肺組織進行大體病理觀察對兩組動物的肺組織切片行HE染色顯示兩組動物均表現(xiàn)為不同程度的肺組織充血、微血管內皮損傷、出血和以中性粒細胞浸潤為主的大量白細胞滲出、聚集；同時兩組動物還出現(xiàn)肺泡間隔增厚、破壞以及部分肺泡萎陷不張等病理改變。上述結果提示兩組劑量內毒素均可成功建立ALI模型。與500ΜGKG劑量組相比700ΜGKG劑量組動物的肺組織損傷程度相對較重但早期死亡率過高不利于進行后期分析。因此在后續(xù)實驗中采用內毒素500ΜGKG建立ALI動物模型。⑶利用內毒素500ΜGKG建立兔ALI模型同時以等量生理鹽水注射設立對照組。分別在12小時、24小時、48小時、72小時和第5天抽取外周血利用流式細胞儀測定外周血中VEGFR2和CD34雙陽性細胞EPC的比率。體外培養(yǎng)細胞后測定EPC的增殖、粘附和遷移功能。結果①對照組外周血EPC比率基本保持穩(wěn)定；模型組外周血EPC比率在內毒素注射后即出現(xiàn)降低24小時后降至最低點其后有所上升但第5天時仍低于對照組。EPC增值、粘附和遷移功能均在內毒素注射后出現(xiàn)降低48小時后降至最低點其后有所上升第5天時仍低于對照組；模型組在各時間點與對照組相比均具有顯著差異。②CMDIL標記的EPC可定植于肺組織內正常對照組各項指標在各時間點均無顯著變化并且與肺損傷對照組和EPC移植組相比均具有顯著差異P005。結論⑴密度梯度離心聯(lián)合貼壁選擇法能夠成功從外周血中分離中EPC并可在體外進行培養(yǎng)擴增。⑵在內毒素構建的兔ALI動物模型中外周血EPC數(shù)量以及增殖、粘附和遷徙功能在ALI早期均出現(xiàn)顯著降低；隨著肺部炎癥的消退EPC數(shù)量和相關功能有所恢復。⑶來源于外周血的自體EPC于移植后可歸巢到受損肺臟并且可減輕內毒素誘導的急性肺損傷病變嚴重程度。自體EPC移植可通過降低ICAM1和P選擇素表達的方式減少ALI起始階段的PMN肺內扣押進而預防肺損傷。自體EPC移植可將內毒素誘導的促炎細胞因子反應部分轉化為抗炎細胞因子反應同時可還可通過減少肺組織細胞凋亡發(fā)揮治療作用EPC培養(yǎng)液移植可在一定程度上減輕內毒素誘導的肺損傷具有用作輔助治療的潛力同時亦表明EPC旁分泌為EPC治療ALI的作用機制之一。

簡介：西南醫(yī)科大學碩士學位論文中圖分類號中圖分類號R89；R36；R39碩士學位論文LYN在肺腺癌中的表達及在肺腺癌中的表達及LYN高表達對高表達對A549細胞生物學行為的影響細胞生物學行為的影響院（系）、所院（系）、所臨床醫(yī)學院研究生姓名研究生姓名沈琴琴學科、專學科、專業(yè)內科學導師姓導師姓名李國平教授二〇一六年四月二〇一六年四月西南醫(yī)科大學碩士學位論文15參考文獻4916英漢縮略詞對照表522致謝533LYN與惡性腫瘤（綜述）54

簡介：點擊查看更多人及小鼠CXCR3基因轉染細胞株的構建與鼠抗人CXCR3單克隆抗體的研制及生物學功能研究.pdf精彩內容。

簡介：近年來，基因組測序技術的快速發(fā)展，加深了人們對腫瘤異質性的認識，含有大量腫瘤臨床樣本多組學數(shù)據(jù)庫的TCGA及ONCOMINE分析平臺為腫瘤個體差異的基因分型、治療與生存期的整合研究提供了大樣本數(shù)據(jù)庫，受到國內外學者的廣泛關注，并越來越多地運用到腫瘤的個體化精準治療的研究中來。肝細胞癌HEPATOCELLULARCARCINOMA，HCC是常見的惡性腫瘤之一，現(xiàn)已成為中國第二世界第三位的癌癥死亡原因。中國為肝癌高發(fā)病率國家，手術切除被認為是可能治愈初診HCC患者的療法，但只有約10％～20％的患者腫瘤可切除，且手術病人面臨腫瘤復發(fā)的可能，最近的統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)2000年至2014年間中國肝癌患者5年生存率僅為141％。近年來針對肝癌靶向治療藥物的研發(fā)逐漸成為熱點，但由于大量不同癌基因以及抑癌基因的突變參與了肝細胞癌的發(fā)生發(fā)展，而其精確的分子機制尚不完全清楚，導致靶向制劑對腫瘤患者個體的治療效果差異大，藥物靶向性較低。目前，作為首個美國FDA批準上市，用于晚期HCC靶向治療的多激酶抑制劑索拉菲尼，其有效率也僅為25％。1995年LEVER在THELANCET雜志發(fā)表一項大型開創(chuàng)性回顧研究，發(fā)現(xiàn)服用血管緊張素酶抑制劑ANGIOTENSINCONVERTINGENZYMEINHIBITS，ACEIS和血管緊張素受體抑制劑ANGOTENSINRECEPTERBLOCKERS，ARBS的病人比未服用該類藥物的病人患乳腺癌和肺癌的風險更低。隨后另一部分的學者進行相關研究卻未得到類似結果。這個不同的研究結果引起眾多學者的關注，在這些研究中除了入選患者種族、人群及服藥周期等不同因素外，由于受到基因測序技術的限制，大部分的患者未做個體基因表達譜測定，導致患者個體基因差異未做考慮。在后續(xù)的研究中發(fā)現(xiàn)，在腎素血管緊張素系統(tǒng)中一個關鍵受體AT1RTYPE1ANGIOTENSINⅡ其編碼的基因AGTR1在多個腫瘤中發(fā)生異質性表達，并且高表達該基因會引起多種腫瘤包括乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、胃癌等的不良預后，但是AGTR1基因在肝細胞癌中的表達及對肝癌的影響卻少有報道。對TCGA數(shù)據(jù)庫中全部3個肝細胞癌的臨床374例RNA芯片數(shù)據(jù)的AGTR1基因表達與臨床生存期的相關性進行分析，提示AGTR1在肝細胞癌的發(fā)生發(fā)展中可能具有重要作用的基礎上，進行了AGTR1在肝細胞癌中的表達及其對肝癌影響的研究。第一部分AGTR1差異表達對肝細胞癌發(fā)展的影響選用ONCOMINE數(shù)據(jù)庫中全部3個肝細胞癌的臨床347例RNA芯片數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)AGTR1基因在這3個數(shù)據(jù)集中均位于過表達基因前5％，并在部分肝細胞癌患者中出現(xiàn)高表達。同時在TCGA數(shù)據(jù)庫中對全部374例的肝細胞癌臨床樣本進行差異分析，發(fā)現(xiàn)AGTR1表達前80位和后80位的樣本AGTR1的相對表達具有顯著差異，進一步結合數(shù)據(jù)庫中肝細胞癌樣本預后數(shù)據(jù)，采用KAPLANMEIER生存分析，發(fā)現(xiàn)低表達組患者的生存期較高表達組顯著延長。以上結果說明，AGTR1在部分肝細胞癌患者中呈高表達，且這種高表達與患者的生存期相關，由此初步推斷AGTR1在肝細胞癌的發(fā)生發(fā)展中可能具有重要作用。為了證明AGTR1基因在肝細胞癌發(fā)生、發(fā)展及轉移中的作用，篩選低表達AGTR1的SMMC7721和BEL7404細胞，對它們進行過表達AGTR1的改造，同時選擇高表達AGTR1的MHCC97H細胞進行干擾表達的改造，體內外研究AGTR1對肝細胞癌的作用。結果發(fā)現(xiàn)AGTR1在體外實驗中具有促進腫瘤細胞增殖、克隆形成、細胞侵襲及遷移的作用，而在體內試驗中能加速裸鼠皮下成瘤試驗的腫瘤形成及生長。此外，采用含有LUCIFERINE片段的載體構建SHAGTR1和SHNC，穩(wěn)篩低表達AGTR1的MHCC97H細胞，采用小動物活體成像系統(tǒng)，在體觀察不同AGTR1表達量的MHCC97H細胞在脾臟肝轉移模型中的轉移情況，發(fā)現(xiàn)抑制AGTR1可以降低MHCC97H腫瘤細胞的脾臟肝轉移能力。第二部分AGTR1差異表達影響肝細胞癌生長的作用機制研究為了探討AGTR1促進HCC細胞生長、轉移作用機制，采用WESTENBLOT方法檢測過表達和干擾表達AGTR1對HCC細胞信號通路的影響，發(fā)現(xiàn)過表達HCC細胞中的AGTR1可以促進JAK2、STAT3、ERK的磷酸化，抑制AGTR1則可以降低相應分子的磷酸化。且JAK2特異性抑制劑AG490可以抑制AGTR1介導的HCC細胞的生長、克隆形成、遷移及侵襲能力。此外，先用TCGA數(shù)據(jù)庫中374例肝細胞癌患者的MRNA芯片數(shù)據(jù)，對VEGF與AGTR1進行相關性分析，發(fā)現(xiàn)隨著AGTR1的表達量的上升，VEGF與AGTR1表達相關性也隨之上升。對低表達AGTR1的SMMC7721，BEL7404細胞過表達AGTR1，兩個細胞內VEGF的表達也隨著AGTR1的表達上升而上升。對高表達AGTR1的MHCC97H細胞干擾表達AGTR1，VEGF的表達也隨之下降，且因AGTR1的高表達或過表達引起的VEGFA的上調表達可以被AG490抑制。由此可以推斷，AGTR1的高表達可能會促進細胞內JKA2的磷酸化，進而激活細胞質內STAT3、ERK等分子的磷酸化，這些磷酸化的分子可進入細胞核，啟動VEGF等分子的轉錄、翻譯、合成，促進細胞分泌VEGF等細胞因子，大量新分泌的VEGF與細胞表面的受體結合可能會進一步激活細胞內STAT3、MAPK等信號通路，促進腫瘤內新生血管的生成及細胞的增殖、遷移等生物學過程。第三部分AGTR1抑制劑對HCC細胞體內外抗腫瘤作用效果研究本部分研究中選擇臨床應用時間最長、應用病例最多的洛沙坦作為靶向AGTR1的抑制劑考察其作用效果。在體外實驗中，發(fā)現(xiàn)當洛沙坦?jié)舛葹?～100ΜM時，能夠不同程度的抑制AGTR1高表達的MHCC97H細胞和AGTR1過表達的SMMC7721細胞的體外增殖、克隆形成、遷移及侵襲能力，但對AGTR1低表達的SMMC7721細胞和AGTR1干擾表達的MHCC97H細胞則無上述作用。體內實驗中，選用高表達AGTR1的MHCC97H細胞，在裸鼠皮下成瘤模型中，經過4周給藥，相比空白對照組，20MGKG1～80MGKG1給藥劑量的洛沙坦能不同程度的抑制裸鼠皮下腫瘤的生長。免疫組化分析發(fā)現(xiàn)隨著給藥劑量的增加，瘤內AT1R、VEGFA及CD31蛋白的表達水平顯著下降，血清VEGFA量也隨著洛沙坦的給藥劑量提高而受到不同程度的抑制。由此考察了洛沙坦在體內外水平對AGTR1高表達HCC細胞生長及腫瘤血管形成的抑制作用。綜上所述，本課題通過TCGA數(shù)據(jù)庫中全部肝細胞癌的臨床374例RNA芯片數(shù)據(jù)，對AGTR1基因表達與臨床生存期的相關性進行分析，提示AGTR1在肝細胞癌的發(fā)生發(fā)展中可能具有重要作用，在此基礎上，進行了AGTR1在肝細胞癌中的表達及其對肝癌影響的研究。對6種不同的肝細胞癌細胞系HEPG2、BEL7402、BEL7404、SMMC7721、MHCC97H、HLF與正常肝細胞系QSG7701進行AGTR1的MRNA及蛋白的表達檢測，證實相比正常肝細胞系QSG7701，肝細胞癌細胞系MHCC97H、HLF中AGTR1MRNA和蛋白水平均有顯著的上調表達，而在BEL7404、SMMC7721中AGTR1MRNA和蛋白水平的表達顯著低于正常肝細胞的表達水平。通過驗證臨床肝癌樣本中AGTR1的表達情況，顯示33例肝細胞癌樣本中有20例臨床樣本AGTR1呈上調表達或高表達。進一步通過體內外實驗，發(fā)現(xiàn)過表達AGTR1后可促進HCC細胞體外增殖、克隆形成、細胞侵襲及遷移能力，加速裸鼠皮下腫瘤形成及生長而抑制AGTR1的表達可降低HCC細胞體外增殖、克隆形成、細胞侵襲及遷移能力，并降低HCC腫瘤細胞的脾臟肝轉移能力。通過對AGTR1相關通路的分析，揭示AGTR1高過表達HCC細胞主要通過JAK2STAT3通路介導其生長、增殖、遷移及侵襲過程，同時驗證了AGTR1靶向抑制劑的作用。在藥效實驗中，探討以AGTR1靶向抑制劑洛沙坦對HCC細胞的作用效果，結果發(fā)現(xiàn)在體外試驗中，當洛沙坦?jié)舛葹?～100ΜM時，能夠不同程度的抑制AGTR1高過表達HCC細胞的體外增殖、克隆形成、遷移及侵襲能力。在體內實驗的裸鼠皮下成瘤模型中，經過4周給藥20MGKG1～80MGKG1，洛沙坦能顯著抑制AGTR1高表達HCC細胞裸鼠皮下腫瘤的生長，降低腫瘤組織中AGTR1、VEGFA及CD31蛋白表達。由此證明了洛沙坦在體內外水平具有抑制AGTR1高表達HCC細胞生長的作用。研究結果明確了AGTR1在肝癌發(fā)生發(fā)展中的作用，探討了AGTR1促進肝細胞癌細胞異常生長的可能機制，為AGTR1高表達肝細胞癌靶向治療藥物的發(fā)現(xiàn)及應用提供了實驗數(shù)據(jù)。