AGTR1對肝癌細胞生物學特性影響及其靶向治療作用的實驗研究.pdf

1、近年來，基因組測序技術的快速發(fā)展，加深了人們對腫瘤異質性的認識，含有大量腫瘤臨床樣本多組學數(shù)據(jù)庫的TCGA及Oncomine分析平臺為腫瘤個體差異的基因分型、治療與生存期的整合研究提供了大樣本數(shù)據(jù)庫，受到國內(nèi)外學者的廣泛關注，并越來越多地運用到腫瘤的個體化精準治療的研究中來。
　　肝細胞癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)是常見的惡性腫瘤之一，現(xiàn)已成為中國第二世界第三位的癌癥死亡原因。中國為肝癌高發(fā)病率國

2、家，手術切除被認為是可能治愈初診HCC患者的療法，但只有約10％～20％的患者腫瘤可切除，且手術病人面臨腫瘤復發(fā)的可能，最近的統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)2000年至2014年間中國肝癌患者5年生存率僅為14.1％。
　　近年來針對肝癌靶向治療藥物的研發(fā)逐漸成為熱點，但由于大量不同癌基因以及抑癌基因的突變參與了肝細胞癌的發(fā)生發(fā)展，而其精確的分子機制尚不完全清楚，導致靶向制劑對腫瘤患者個體的治療效果差異大，藥物靶向性較低。目前，作為首個美國FDA批準上

3、市，用于晚期HCC靶向治療的多激酶抑制劑索拉菲尼，其有效率也僅為25％。
　　1995年Lever在The Lancet雜志發(fā)表一項大型開創(chuàng)性回顧研究，發(fā)現(xiàn)服用血管緊張素酶抑制劑(angiotensin converting enzyme inhibitors，ACEIs)和血管緊張素受體抑制劑(angotensin recepter blockers，ARBs)的病人比未服用該類藥物的病人患乳腺癌和肺癌的風險更低。隨后另一部分的

4、學者進行相關研究卻未得到類似結果。這個不同的研究結果引起眾多學者的關注，在這些研究中除了入選患者種族、人群及服藥周期等不同因素外，由于受到基因測序技術的限制，大部分的患者未做個體基因表達譜測定，導致患者個體基因差異未做考慮。在后續(xù)的研究中發(fā)現(xiàn)，在腎素血管緊張素系統(tǒng)中一個關鍵受體AT1R(type-1angiotensinⅡ)其編碼的基因AGTR1在多個腫瘤中發(fā)生異質性表達，并且高表達該基因會引起多種腫瘤包括乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、胃癌

5、等的不良預后，但是AGTR1基因在肝細胞癌中的表達及對肝癌的影響卻少有報道。對TCGA數(shù)據(jù)庫中全部3個肝細胞癌的臨床374例RNA芯片數(shù)據(jù)的AGTR1基因表達與臨床生存期的相關性進行分析，提示AGTR1在肝細胞癌的發(fā)生發(fā)展中可能具有重要作用的基礎上，進行了AGTR1在肝細胞癌中的表達及其對肝癌影響的研究。
　　第一部分 AGTR1差異表達對肝細胞癌發(fā)展的影響
　　選用Oncomine數(shù)據(jù)庫中全部3個肝細胞癌的臨床347例RN

6、A芯片數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)AGTR1基因在這3個數(shù)據(jù)集中均位于過表達基因前5％，并在部分肝細胞癌患者中出現(xiàn)高表達。同時在TCGA數(shù)據(jù)庫中對全部374例的肝細胞癌臨床樣本進行差異分析，發(fā)現(xiàn)AGTR1表達前80位和后80位的樣本AGTR1的相對表達具有顯著差異，進一步結合數(shù)據(jù)庫中肝細胞癌樣本預后數(shù)據(jù)，采用Kaplan-Meier生存分析，發(fā)現(xiàn)低表達組患者的生存期較高表達組顯著延長。以上結果說明，AGTR1在部分肝細胞癌患者中呈高表達，且這種高表達與患

7、者的生存期相關，由此初步推斷AGTR1在肝細胞癌的發(fā)生發(fā)展中可能具有重要作用。為了證明AGTR1基因在肝細胞癌發(fā)生、發(fā)展及轉移中的作用，篩選低表達AGTR1的SMMC-7721和BEL-7404細胞，對它們進行過表達AGTR1的改造，同時選擇高表達AGTR1的MHCC-97H細胞進行干擾表達的改造，體內(nèi)外研究AGTR1對肝細胞癌的作用。結果發(fā)現(xiàn)AGTR1在體外實驗中具有促進腫瘤細胞增殖、克隆形成、細胞侵襲及遷移的作用，而在體內(nèi)試驗中能加

8、速裸鼠皮下成瘤試驗的腫瘤形成及生長。此外，采用含有l(wèi)uciferine片段的載體構建sh-AGTR1和sh-nc，穩(wěn)篩低表達AGTR1的MHCC-97H細胞，采用小動物活體成像系統(tǒng)，在體觀察不同AGTR1表達量的MHCC-97H細胞在脾臟肝轉移模型中的轉移情況，發(fā)現(xiàn)抑制AGTR1可以降低MHCC-97H腫瘤細胞的脾臟肝轉移能力。
　　第二部分 AGTR1差異表達影響肝細胞癌生長的作用機制研究
　　為了探討AGTR1促進HCC

9、細胞生長、轉移作用機制，采用Westen Blot方法檢測過表達和干擾表達AGTR1對HCC細胞信號通路的影響，發(fā)現(xiàn)過表達HCC細胞中的AGTR1可以促進JAK2、STAT3、ERK的磷酸化，抑制AGTR1則可以降低相應分子的磷酸化。且JAK2特異性抑制劑AG490可以抑制AGTR1介導的HCC細胞的生長、克隆形成、遷移及侵襲能力。此外，先用TCGA數(shù)據(jù)庫中374例肝細胞癌患者的mRNA芯片數(shù)據(jù)，對VEGF與AGTR1進行相關性分析，發(fā)

10、現(xiàn)隨著AGTR1的表達量的上升，VEGF與AGTR1表達相關性也隨之上升。對低表達AGTR1的SMMC-7721，BEL-7404細胞過表達AGTR1，兩個細胞內(nèi)VEGF的表達也隨著AGTR1的表達上升而上升。對高表達AGTR1的MHCC-97H細胞干擾表達AGTR1，VEGF的表達也隨之下降，且因AGTR1的高表達或過表達引起的VEGFA的上調(diào)表達可以被AG490抑制。由此可以推斷，AGTR1的高表達可能會促進細胞內(nèi)JKA2的磷酸化，

11、進而激活細胞質內(nèi)STAT3、ERK等分子的磷酸化，這些磷酸化的分子可進入細胞核，啟動VEGF等分子的轉錄、翻譯、合成，促進細胞分泌VEGF等細胞因子，大量新分泌的VEGF與細胞表面的受體結合可能會進一步激活細胞內(nèi)STAT3、MAPK等信號通路，促進腫瘤內(nèi)新生血管的生成及細胞的增殖、遷移等生物學過程。
　　第三部分 AGTR1抑制劑對HCC細胞體內(nèi)外抗腫瘤作用效果研究
　　本部分研究中選擇臨床應用時間最長、應用病例最多的洛沙坦

12、作為靶向AGTR1的抑制劑考察其作用效果。在體外實驗中，發(fā)現(xiàn)當洛沙坦?jié)舛葹?～100μM時，能夠不同程度的抑制AGTR1高表達的MHCC-97H細胞和AGTR1過表達的SMMC-7721細胞的體外增殖、克隆形成、遷移及侵襲能力，但對AGTR1低表達的SMMC-7721細胞和AGTR1干擾表達的MHCC-97H細胞則無上述作用。體內(nèi)實驗中，選用高表達AGTR1的MHCC-97H細胞，在裸鼠皮下成瘤模型中，經(jīng)過4周給藥，相比空白對照組，20

13、mg·Kg-1～80mg·Kg-1給藥劑量的洛沙坦能不同程度的抑制裸鼠皮下腫瘤的生長。免疫組化分析發(fā)現(xiàn)隨著給藥劑量的增加，瘤內(nèi)AT1R、VEGFA及CD31蛋白的表達水平顯著下降，血清VEGFA量也隨著洛沙坦的給藥劑量提高而受到不同程度的抑制。由此考察了洛沙坦在體內(nèi)外水平對AGTR1高表達HCC細胞生長及腫瘤血管形成的抑制作用。
　　綜上所述，本課題通過TCGA數(shù)據(jù)庫中全部肝細胞癌的臨床374例RNA芯片數(shù)據(jù)，對AGTR1基因表達

14、與臨床生存期的相關性進行分析，提示AGTR1在肝細胞癌的發(fā)生發(fā)展中可能具有重要作用，在此基礎上，進行了AGTR1在肝細胞癌中的表達及其對肝癌影響的研究。對6種不同的肝細胞癌細胞系(HepG2、BEL-7402、BEL-7404、SMMC-7721、MHCC97H、HLF)與正常肝細胞系(QSG-7701)進行AGTR1的mRNA及蛋白的表達檢測，證實相比正常肝細胞系(QSG-7701)，肝細胞癌細胞系MHCC97H、HLF中AGTR1m

15、RNA和蛋白水平均有顯著的上調(diào)表達，而在BEL-7404、SMMC-7721中AGTR1mRNA和蛋白水平的表達顯著低于正常肝細胞的表達水平。通過驗證臨床肝癌樣本中AGTR1的表達情況，顯示33例肝細胞癌樣本中有20例臨床樣本AGTR1呈上調(diào)表達或高表達。進一步通過體內(nèi)外實驗，發(fā)現(xiàn)過表達AGTR1后可促進HCC細胞體外增殖、克隆形成、細胞侵襲及遷移能力，加速裸鼠皮下腫瘤形成及生長;而抑制AGTR1的表達可降低HCC細胞體外增殖、克隆形成

16、、細胞侵襲及遷移能力，并降低HCC腫瘤細胞的脾臟肝轉移能力。通過對AGTR1相關通路的分析，揭示AGTR1高/過表達HCC細胞主要通過JAK2/STAT3通路介導其生長、增殖、遷移及侵襲過程，同時驗證了AGTR1靶向抑制劑的作用。在藥效實驗中，探討以AGTR1靶向抑制劑洛沙坦對HCC細胞的作用效果，結果發(fā)現(xiàn)在體外試驗中，當洛沙坦?jié)舛葹?～100μM時，能夠不同程度的抑制AGTR1高/過表達HCC細胞的體外增殖、克隆形成、遷移及侵襲能力。

17、在體內(nèi)實驗的裸鼠皮下成瘤模型中，經(jīng)過4周給藥(20mg·Kg-1～80mg·Kg-1)，洛沙坦能顯著抑制AGTR1高表達HCC細胞裸鼠皮下腫瘤的生長，降低腫瘤組織中AGTR1、VEGFA及CD31蛋白表達。由此證明了洛沙坦在體內(nèi)外水平具有抑制AGTR1高表達HCC細胞生長的作用。研究結果明確了AGTR1在肝癌發(fā)生發(fā)展中的作用，探討了AGTR1促進肝細胞癌細胞異常生長的可能機制，為AGTR1高表達肝細胞癌靶向治療藥物的發(fā)現(xiàn)及應用提供了實驗