肝癌細(xì)胞自噬小體的誘導(dǎo)及其生物學(xué)特性研究.pdf

1、相關(guān)背景及研究目的： 自噬是廣泛存在于真核細(xì)胞中的一條胞內(nèi)蛋白的降解途徑，它主要對(duì)體內(nèi)的長(zhǎng)壽蛋白及一些細(xì)胞器進(jìn)行降解。自噬是一個(gè)進(jìn)化保守的細(xì)胞生物學(xué)行為，其分子機(jī)制從酵母到哺乳動(dòng)物十分相似。在自噬過(guò)程中，待降解的胞漿組分及細(xì)胞器被包裹在一種被稱為自噬小體的雙層膜結(jié)構(gòu)中，最終與溶酶體融合形成自噬溶酶體，實(shí)現(xiàn)胞內(nèi)物質(zhì)的降解。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞發(fā)生自噬的過(guò)程中，涉及到兩種泛素樣加工修飾系統(tǒng)：Atg-12結(jié)合系統(tǒng)和LC3修飾系統(tǒng)。Atg-1

2、2結(jié)合系統(tǒng)對(duì)于前自噬小體的形成是非常重要的，而LC3修飾系統(tǒng)則與自噬小體的形成密切相關(guān)。LC3有兩種形式：游離型的LC3-Ⅰ及膜結(jié)合型的LC3-Ⅱ。目前認(rèn)為，LC3-Ⅱ是自噬小體的特征性標(biāo)記。 肝癌（HCC）是惡性程度極高、且預(yù)后極差的惡性腫瘤之一，嚴(yán)重威脅人類的健康。治愈性切除手術(shù)或肝移植是目前肝癌病人首選的治療方法，但由于肝癌的肝內(nèi)多發(fā)病灶、肝外轉(zhuǎn)移及供體缺乏等因素，新診斷出的肝癌病人只有10％～15％可采取手術(shù)治療。臨床資

3、料顯示，大部分肝癌病人對(duì)化療、放療等治療不敏感，因此，肝癌的臨床治療迫切需要新的方法和手段。腫瘤生物治療作為一種新的肝癌治療策略，具有特異性強(qiáng)、毒副作用小等優(yōu)點(diǎn)，越來(lái)越受到人們重視。其中，以樹(shù)突狀細(xì)胞（DC）為載體的肝癌疫苗目前已成為肝癌生物治療的研究熱點(diǎn)。 pAPC交叉遞呈的抗原多肽是誘導(dǎo)特異性效應(yīng)細(xì)胞的物質(zhì)基礎(chǔ)、而腫瘤細(xì)胞直接遞呈的抗原多肽是效應(yīng)細(xì)胞有效識(shí)別并殺傷腫瘤細(xì)胞的靶點(diǎn)。一方面，腫瘤細(xì)胞直接遞呈的抗原多肽主要來(lái)源于

4、腫瘤細(xì)胞的短壽蛋白（平均半衰期約為10分鐘）；另一方面，pAPC交叉遞呈的抗原多肽主要來(lái)源于腫瘤細(xì)胞的長(zhǎng)壽蛋白（經(jīng)自噬途徑降解），兩者間可能存在著不對(duì)稱現(xiàn)象，因此，解決上述的不對(duì)稱性是腫瘤免疫需要解決的課題。 本研究結(jié)合前期的工作基礎(chǔ)，以轉(zhuǎn)HBV全基因人肝癌細(xì)胞株-HepG2．215為靶細(xì)胞，采用蛋白酶體抑制劑阻斷腫瘤短壽蛋白的降解，促使其進(jìn)入自噬途徑，達(dá)到募集短壽蛋白的目的；采用自噬小體誘導(dǎo)劑促進(jìn)自噬形成；采用NH4Cl抑制溶

5、酶體功能，阻止溶酶體對(duì)自噬小體中蛋白的降解。在此基礎(chǔ)上摹集自噬小體（Drips ill blebs，簡(jiǎn)稱DRibble），對(duì)DRibble的生物學(xué)特性進(jìn)行初步研究。 方法： 1．HepG2．215細(xì)胞體外常規(guī)培養(yǎng)，待細(xì)胞狀態(tài)良好密度合適時(shí)，加入不同的藥物阻斷蛋白酶體降解途徑、促進(jìn)自噬、抑制溶酶體酸化等，誘導(dǎo)并摹集各種DRibble； 2．采用分步高速離心法將DRibble提取出來(lái)，并用PBS重懸分裝； 3

6、．透射電子顯微鏡觀察DRibble的形態(tài)； 4．熒光定量PCR定量檢測(cè)HepG2．215細(xì)胞及DRibble中HBV-DNA的含量； 5．以HBsAg為靶蛋白，采用ELISA法檢測(cè)DRibble及細(xì)胞裂解物中HBsAg的含量及其變化； 6．Western blot檢測(cè)各組細(xì)胞裂解物中HBsAg及其變化，并檢測(cè)自噬小體特征 性標(biāo)志物-LC3-Ⅱ的水平； 7．淋巴結(jié)注射DRibble方法免疫Balb/

7、c小鼠，2周后皮下注射DRibble增強(qiáng)免疫，檢測(cè)小鼠血清中抗HBs抗體的產(chǎn)生情況； 8．以HBsAg預(yù)先免疫小鼠，收獲免疫小鼠的脾臟及淋巴結(jié)，制成混合淋巴細(xì)胞懸液，以可溶性HBsAg、DRibble或裂解物體外刺激72小時(shí)，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清并以ELISA法檢測(cè)其IFN-γ與IL-4水平； 9．磁珠分選出免疫小鼠的CD8+與CD4+T細(xì)胞，上述抗原與DC共孵育6小時(shí)后洗去抗原，然后與T細(xì)胞共培養(yǎng)72小時(shí)，檢測(cè)上清中IFN

8、-γ與IL-4含量； 10．以DRibble預(yù)先免疫小鼠，收獲免疫小鼠的淋巴細(xì)胞，體外分別用可溶性HBsAg、DRibble以及細(xì)胞裂解液刺激72小時(shí)，ELISA法檢測(cè)其IFN-γ與IL-4。 結(jié)果： 1．透射電子顯微鏡觀察到含雙層膜結(jié)構(gòu)的小體，提示有效地提取了自噬小體/DRibble； 2．熒光定量PCR檢測(cè)到HepG2．215細(xì)胞中含有高水平的HBsAg-DNA，而從DRibble中未檢測(cè)到HBsAg

9、-DNA； 3．ELISA法檢測(cè)HBsAg顯示：蛋白酶體抑制劑能夠阻斷HBsAg短壽蛋白的降解，自噬誘導(dǎo)劑能夠促進(jìn)自噬小體的形成及外排，NH4Cl能夠阻止溶酶體對(duì)自噬小體中蛋白的降解，從而使自噬小體生成增多、降解減少，HBsAg蛋白含量相應(yīng)地增加； 4．Western blot檢測(cè)HBsAg顯示：在蛋白酶體抑制劑作用下，HBsAg短壽片段得以保留，NH4Cl抑制溶酶體對(duì)自噬小體中蛋白的降解，使HBsAg長(zhǎng)短片段均得以富集

10、；在各組細(xì)胞裂解物中，均檢測(cè)到自噬特異性標(biāo)記物L(fēng)C3，且以胞漿型的LC3-Ⅰ為主，NH4Cl處理組LC3含量最多；在各組DRibble中，檢測(cè)到的LC3以膜結(jié)合型的LC3-Ⅱ?yàn)橹?，且NH4Cl處理組LC3-Ⅱ的含量明顯高于其他組； 5．DRibble免疫小鼠血清能檢測(cè)到高水平的抗HBs抗體； 6．DRibble在體外單獨(dú)刺激HBsAg免疫小鼠淋巴細(xì)胞時(shí)能夠產(chǎn)生高水平的IFN-γ和低水平的IL-4，IFN-γ水平顯著高于可

11、溶性HBsAg刺激組和細(xì)胞裂解液刺激組，而且DRibble的最強(qiáng)刺激劑量是可溶性HBsAg的1/300； 7．DC/DRibble和DC/HBsAg刺激HBsAg特異性CD4+T細(xì)胞產(chǎn)生的IFN-γ水平無(wú)明顯差別；但DC/DRibble刺激HBsAg特異性CD8+T細(xì)胞產(chǎn)生的IFN-γ水平顯著高于DC/HBsAg刺激組和細(xì)胞裂解液刺激組； 8．體外用DRibble對(duì)DRibble免疫小鼠淋巴細(xì)胞進(jìn)行再刺激時(shí)可產(chǎn)生高水平的