Dicer1基因?qū)Υ笫笮募〖?xì)胞H9c2生物學(xué)特性的影響及其調(diào)控機(jī)制.pdf

1、目的：
　　先天性心臟病(Congenital Heart Defect，CHD)是最常見的嬰幼兒先天畸形，發(fā)病率約為1％～2％，也是嬰幼兒非感染性疾病死亡的最主要原因。由于缺乏特異性早期診斷方法和治療策略相對(duì)單一且風(fēng)險(xiǎn)大，鑒定CHD相關(guān)易感基因并闡明其作用機(jī)理和調(diào)控機(jī)制，將具有重要的理論和實(shí)踐意義。
　　心臟發(fā)育依賴于不同類型細(xì)胞（如心肌細(xì)胞、心內(nèi)膜細(xì)胞、心臟神經(jīng)嵴細(xì)胞）的遷移、分化、增殖和凋亡，涉及各種轉(zhuǎn)錄因子、細(xì)胞黏附

2、分子、信號(hào)分子所構(gòu)成的精確而復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。上述相關(guān)因素的改變將導(dǎo)致心臟異常發(fā)育而表現(xiàn)為CHD。
　　Dicer1基因定位于14q32.13，編碼一種具有1922個(gè)氨基酸殘基的核糖核酸酶。Dicer1酶能夠識(shí)別具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的單鏈前體miRNA(precursor miRNA，pre-miRNA)或雙鏈RNA（double strand RNA，dsRNA），并將其切割成21～23nt的成熟miRNA或siRNA。Dicer1基因表

3、達(dá)異常與腫瘤、多發(fā)性硬化癥、突發(fā)性聽力喪失等疾病密切相關(guān)。Dicer1基因條件性敲除小鼠表現(xiàn)出心臟畸形，但關(guān)于Dicer1基因在心臟發(fā)育過(guò)程中的具體作用機(jī)理及其調(diào)控機(jī)制尚不清楚。
　　Nfatc3(Nuclear Factor of Activated T cells c3，Nfatc3)基因定位于16q22.2，編碼產(chǎn)物Nfatc3蛋白作為轉(zhuǎn)錄因子，可以與靶基因調(diào)控序列中Nfatc3結(jié)合位點(diǎn)（一致序列為-GGAAA-）結(jié)合，調(diào)控

4、靶基因的表達(dá)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)提示Nfatc3基因參與正常心臟發(fā)育過(guò)程。應(yīng)用生物信息學(xué)軟件，我們?cè)贒icer1基因啟動(dòng)子區(qū)預(yù)測(cè)到轉(zhuǎn)錄因子Nfatc3結(jié)合位點(diǎn)。我們推測(cè)，Nfatc3基因可能調(diào)控Dicer1基因參與正常心臟發(fā)育。
　　因此，本研究首先通過(guò)檢測(cè)Dicer1-shRNA對(duì)大鼠心肌細(xì)胞H9c2生物學(xué)特性的影響，明確Dicer1基因表達(dá)降低導(dǎo)致心臟畸形的可能作用機(jī)理;其次通過(guò)染色質(zhì)免疫沉淀（chromatin immunopreci

5、pitation，ChIP）、螢光素酶報(bào)告系統(tǒng)、RNA干擾（RNA interference，RNAi）等功能研究，闡明Nfatc3基因?qū)icer1基因的調(diào)控作用及其對(duì)大鼠心肌細(xì)胞H9c2生物學(xué)特性的影響，為揭示Dicer1基因及其調(diào)控基因Nfatc3在心臟發(fā)育過(guò)程中的作用提供理論依據(jù)。
　　方法：
　　一、實(shí)驗(yàn)材料
　　1、細(xì)胞株
　　大鼠心肌細(xì)胞H9c2
　　2、組織標(biāo)本
　　10例心肌組織標(biāo)本

6、由中國(guó)醫(yī)科大學(xué)盛京醫(yī)院提供，標(biāo)本采集均已簽署知情同意書，并經(jīng)醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審查批準(zhǔn)通過(guò)。
　　二、實(shí)驗(yàn)方法
　　1、Dicer1基因RNA干擾實(shí)驗(yàn)
　　Dicer1-shRNA轉(zhuǎn)染大鼠心肌細(xì)胞H9c2，Real-time PCR和Western Blot檢測(cè)Dicer1基因表達(dá)。
　　2、Dicer1-shRNA對(duì)大鼠心肌細(xì)胞H9c2生物學(xué)特性的影響
　　CCK-8活細(xì)胞染色法檢測(cè)細(xì)胞增殖率，Western

7、 Blot分析PCNA表達(dá)水平;PI單染法測(cè)定細(xì)胞周期，Western Blot分析Cyclin E1和Cyclin A表達(dá)水平;AnnexinⅤ-APC/PI方法檢測(cè)細(xì)胞凋亡，Western Blot分析Caspase3表達(dá)水平。
　　3、Dicer1基因啟動(dòng)子區(qū)Nfatc3結(jié)合位點(diǎn)的鑒定
　　生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)Dicer1基因啟動(dòng)子區(qū)Nfatc3結(jié)合位點(diǎn)，ChIP實(shí)驗(yàn)鑒定Nfatc3與Dicer1基因啟動(dòng)子區(qū)Nfatc3

8、結(jié)合位點(diǎn)的特異性結(jié)合;共轉(zhuǎn)染Nfatc3-siRNA和Dicer1基因啟動(dòng)子區(qū)螢光素酶重組載體pDicer1，應(yīng)用螢光素酶活性檢測(cè)系統(tǒng)分析螢光素酶活性，驗(yàn)證Nfatc3與Dicer1基因啟動(dòng)子區(qū)特異性結(jié)合。
　　4、心肌組織Nfatc3基因、Dicer1基因表達(dá)分析
　　在10例心肌組織中，Western Blot檢測(cè)Nfatc3蛋白表達(dá)，Real-time PCR檢測(cè)Dicer1 mRNA表達(dá)，并進(jìn)行相關(guān)性分析。
　

9、　5、Nfatc3基因RNA干擾實(shí)驗(yàn)
　　Nfatc3-siRNA轉(zhuǎn)染大鼠心肌細(xì)胞H9c2，Western Blot檢測(cè)Nfatc3蛋白表達(dá)，Real-time PCR和Western Blot分析Dicer1基因表達(dá)水平。
　　6、Nfatc3-siRNA對(duì)大鼠心肌細(xì)胞H9c2生物學(xué)特性的影響
　　CCK-8活細(xì)胞染色法檢測(cè)細(xì)胞增殖率，Western Blot分析PCNA表達(dá)水平;PI單染法測(cè)定細(xì)胞周期，Wester

10、n Blot分析Cyclin E1和Cyclin A表達(dá)水平;AnnexinⅤ-FITC/PI方法檢測(cè)細(xì)胞凋亡。
　　結(jié)果：
　　1、Dicer1-shRNA能夠有效抑制Dicer1基因表達(dá)
　　與轉(zhuǎn)染Negative control相比，轉(zhuǎn)染Dicer1-shRNA3d后，Dicer1基因mRNA和蛋白表達(dá)水平分別下降79％和54％(P＜0.05)。
　　2、Dicer1基因表達(dá)降低能夠抑制心肌細(xì)胞增殖

11、　　與轉(zhuǎn)染Negative Control相比，轉(zhuǎn)染Dicer1-shRNA3d后，活細(xì)胞數(shù)顯著減少，細(xì)胞增殖抑制率為31.86±0.02％，PCNA表達(dá)降低31％(P＜0.05)。
　　3、Dicer1基因表達(dá)降低使細(xì)胞周期重新分布，阻滯于S期
　　與轉(zhuǎn)染Negative Control相比，轉(zhuǎn)染Dicer1-shRNA4d后，G1期細(xì)胞數(shù)顯著減少，所占百分比為63.21±2.82％(P＜0.05)，而S期細(xì)胞數(shù)顯著增多，

12、所占百分比為21.22±6.0％，Cyclin E1表達(dá)升高35％，Cyclin A表達(dá)降低32％(P＜0.05)。
　　4、Dicer1基因表達(dá)降低能夠促進(jìn)心肌細(xì)胞凋亡
　　與轉(zhuǎn)染Negative Control相比，轉(zhuǎn)染Dicer1-shRNA4d后，心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)為13.04±3.0％，Caspase3表達(dá)升高16％(P＜0.05)。
　　5、Nfatc3能夠與Dicer1基因啟動(dòng)子區(qū)Nfatc3結(jié)合位點(diǎn)特異性

13、結(jié)合
　　生物信息學(xué)軟件在Dicer1基因啟動(dòng)子區(qū)預(yù)測(cè)到3個(gè)潛在的Nfatc3結(jié)合位點(diǎn)，ChIP實(shí)驗(yàn)在體內(nèi)鑒定Nfatc3能夠與Dicer1基因啟動(dòng)子區(qū)-476～-472bp處Nfatc3結(jié)合位點(diǎn)特異性結(jié)合;螢光素酶報(bào)告系統(tǒng)證明轉(zhuǎn)錄因子Nfatc3可與Dicer1基因啟動(dòng)子區(qū)特異性結(jié)合并影響Dicer1基因轉(zhuǎn)錄活性。
　　6、心肌組織中Nfatc3基因與Dicer1基因表達(dá)呈正相關(guān)
　　Nfatc3蛋白和Dicer1

14、mRNA的表達(dá)呈顯著正相關(guān)(r=0.67，P＜0.05)。
　　7、Nfatc3基因正調(diào)控內(nèi)源性Dicer1基因表達(dá)
　　與轉(zhuǎn)染Negative control相比，轉(zhuǎn)染Nfatc3-siRNA2d后，Nfatc3蛋白表達(dá)水平下降73％(P＜0.05)，Dicer1基因mRNA和蛋白表達(dá)水平分別下降64％和49％（P＜0.05）。
　　8、Nfatc3基因表達(dá)降低能夠抑制心肌細(xì)胞增殖
　　與轉(zhuǎn)染Negative

15、control相比，轉(zhuǎn)染Nfatc3-siRNA3d后，細(xì)胞增殖抑制率為15.86±0.02％，PCNA表達(dá)降低29％(P＜0.05)。
　　9、Nfatc3基因表達(dá)降低使細(xì)胞周期重新分布，阻滯于S期
　　與轉(zhuǎn)染Negative control相比，轉(zhuǎn)染Nfatc3-siRNA3d后，G1期細(xì)胞數(shù)顯著減少，所占百分比為53.80±4.6％(P＜0.05)，而S期細(xì)胞數(shù)顯著增多，所占百分比為30.10±4.10％，Cyclin

16、 E1表達(dá)升高15％，Cyclin A表達(dá)降低21％(P＜0.05)。
　　10、Nfatc3基因表達(dá)降低不影響心肌細(xì)胞凋亡
　　與轉(zhuǎn)染Negative control相比，轉(zhuǎn)染Nfatc3-siRNA3d后，心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)為0.37±0.12％(P＞0.05)。
　　結(jié)論：
　　1、Dicer1基因表達(dá)降低能夠促進(jìn)心肌細(xì)胞凋亡，抑制心肌細(xì)胞增殖，使細(xì)胞周期重新分布、阻滯于S期。
　　2、Nfatc3基因