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文檔簡介
1、近年來,越來越多的研究表明,心血管疾病的發(fā)生發(fā)展與細胞凋亡有關(guān)。多種刺激均可誘導(dǎo)心肌細胞凋亡,如缺氧、缺血再灌注、氧化應(yīng)激及腫瘤壞死因子α(Tumor necrosis factorα,TNFα)等。其中,TNFα可通過與心肌細胞膜上TNF-R1結(jié)合,激活死亡受體途徑介導(dǎo)細胞凋亡。Mipu1是本實驗室克隆的一個大鼠心肌缺血預(yù)適應(yīng)誘導(dǎo)表達上調(diào)的新基因(GenBank登錄號AY221750),已證實Mipu1是一個鋅指蛋白型轉(zhuǎn)錄抑制因子。而
2、生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)Bcl-2家族成員Bid基因啟動子區(qū)含有Mipu1的結(jié)合位點,因此本研究旨在觀察Mipu1對TNFα誘導(dǎo)的心肌細胞凋亡的影響,及Mipu1對Bid基因表達的調(diào)控作用,從而探討Mipu1減輕TNFα所致H9c2心肌細胞凋亡的機制。 本研究擬采用TNFα(20 ng/ml,24h)處理大鼠心肌細胞H9c2,建立細胞凋亡模型。通過瞬時轉(zhuǎn)染Mipu1真核表達質(zhì)粒pcDNA3.1-Mipu1,使細胞過表達Mipu1。實驗
3、分為pcDNA3.1、pcDNA3.1+TNFα、pcDNA3.1-Mipu1、pcDNA3.1-Mipu1+TNFα四組。為觀察Mipu1對TNFα所致H9c2細胞凋亡的影響,采用Hoechst染色、流式細胞術(shù)(flow cytometry,F(xiàn)CM)及Caspase活性檢測細胞凋亡百分率及Caspase8、9、3的活性;為觀察Mipu1對凋亡相關(guān)基因Bid基因表達水平的影響,采用細胞間接免疫熒光術(shù)、Western-blot、RT-PC
4、R及熒光實時定量PCR(Real-time quantitative PCR)方法檢測Bid蛋白及mRNA的表達;為進一步探討Mipu1對Bid基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的機制,采用熒光素酶報告基因及Target Detection Assay檢測Bid基因轉(zhuǎn)錄活性及Mipu1蛋白與Bid啟動子區(qū)的結(jié)合作用。 主要結(jié)果如下:①TNFα處理H9c2細胞后,細胞凋亡百分率明顯增加(p<0.01 VS pcDNA3.1);瞬時轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-
5、Mipu1后,TNFα誘導(dǎo)的H9c2細胞凋亡百分率增加受到明顯抑制(p<0.01 VSpcDNA3.1+TNFα)。TNFα處理后,Caspase-8和Caspase-3活性明顯增加(p<0.01 VS pcDNA3.1);轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-Mipu1后,TNFα誘導(dǎo)的Caspase-8和Caspase-3活化明顯減少(p<0.01 VSpcDNA3.1+TNFα);而Caspase-9的活性在各組間比較無明顯差異。②細胞間接免疫熒
6、光實驗發(fā)現(xiàn),瞬時轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-Mipu1后,H9c2胞漿中Bid蛋白表達明顯減少。Mipu1過表達使基礎(chǔ)狀態(tài)下的Bid蛋白及mRNA表達水平下調(diào)(p<0.05 VS pcDNA3.1);細胞經(jīng)TNFα處理之后,Bid蛋白及mRNA表達水平升高(p<0.05 VS pcDNA3.1),Mipu1過表達使TNFα誘導(dǎo)的Bid蛋白及mRNA表達水平下調(diào)(p<0.05 VS pcDNA3.1+TNFα);并且隨著pcDNA3.1-Mip
7、u1轉(zhuǎn)入的增多,Bid蛋白表達水平逐漸下降,兩者呈量效關(guān)系。③Mipu1過表達使基礎(chǔ)狀態(tài)下的Bid基因轉(zhuǎn)錄活性下調(diào)(p<0.05 VS pcDNA3.1);細胞經(jīng)TNFα處理之后,Bid基因轉(zhuǎn)錄活性明顯升高(p<0.01 VS pcDNA3.1),Mipu1過表達使TNFα誘導(dǎo)的Bid基因轉(zhuǎn)錄活性明顯降低(p<0.01 VSpcDNA3.1+TNFα);并且隨著pcDNA3.1-Mipu1轉(zhuǎn)入的增多,Bid基因轉(zhuǎn)錄活性逐漸下降,兩者呈量
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