BMP2對(duì)H9c2心肌細(xì)胞組蛋白乙?；揎椀恼{(diào)控作用及其機(jī)制研究.pdf

1、本文從以下幾方面進(jìn)行了詳細(xì)闡述。
　　第一部分:BMP2對(duì)H9c2心肌細(xì)胞心臟核心轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)及組蛋白乙酰化修飾的調(diào)控作用。
　　目的：
　　構(gòu)建BMP2過(guò)表達(dá)的心肌細(xì)胞模型，檢測(cè)BMP2對(duì)心臟核心轉(zhuǎn)錄因子GATA4、MEF2C和Tbx5表達(dá)的影響，并研究BMP2對(duì)H9c2心肌細(xì)胞總組蛋白H3、基因啟動(dòng)子區(qū)組蛋白H3乙?；揎椉敖M蛋白乙?；?HATs)亞型p300和GCN5的調(diào)控作用，以證實(shí)我們的科學(xué)假設(shè):BMP2是

2、心肌細(xì)胞組蛋白乙酰化修飾的上游信號(hào)通路之一。
　　方法：
　　(1)過(guò)表達(dá)BMP2的腺病毒(AdBMP2)及對(duì)照空腺病毒(AdGFP)在HEK293細(xì)胞中擴(kuò)增后，分別以不同滴度轉(zhuǎn)染大鼠H9c2心肌細(xì)胞，24h后熒光倒置顯微鏡下觀察AdBMP2/AdGFP腺病毒轉(zhuǎn)染細(xì)胞綠色熒光蛋白的表達(dá)情況，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)AdBMP2/AdGFP腺病毒轉(zhuǎn)染效率。
　　(2) AdBMP2/AdGFP腺病毒轉(zhuǎn)染H9c2心肌細(xì)胞24h、48

3、h和72h后收集細(xì)胞，提取mRNA，Real-Time qRT-PCR檢測(cè)各處理組細(xì)胞BMP2、MEF2C、GATA4和Tbx5及HATs亞型p300和GCN5的mRNA表達(dá)水平，篩選最佳干預(yù)時(shí)間。
　　(3) AdBMP2/AdGFP腺病毒轉(zhuǎn)染H9c2心肌細(xì)胞48h后收集細(xì)胞，比色法檢測(cè)各處理組H9c2心肌細(xì)胞核蛋白HATs活性，Western-blotting檢測(cè)各處理組細(xì)胞總組蛋白H3的乙酰化水平，ChIP-Real-Tim

4、e qPCR檢測(cè)各處理組細(xì)胞MEF2C、GATA4和Tbx5啟動(dòng)子區(qū)組蛋白H3乙?；健?br>　　結(jié)果：
　　(1) AdBMP2轉(zhuǎn)染H9c2心肌細(xì)胞24h后，熒光倒置顯微鏡下可見(jiàn)細(xì)胞中出現(xiàn)大量綠色熒光，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示AdBMP2轉(zhuǎn)染效率可達(dá)90％以上。
　　(2) AdBMP2轉(zhuǎn)染H9c2心肌細(xì)胞24h、48h、72h后，BMP2及心臟核心轉(zhuǎn)錄因子MEF2C和GATA4的mRNA表達(dá)水平較對(duì)照組明顯升高(P＜0

5、.05)，并于轉(zhuǎn)染后48h達(dá)到高峰，而Tbx5的表達(dá)沒(méi)有明顯變化。
　　(3) AdBMP2轉(zhuǎn)染H9c2心肌細(xì)胞48h后，HATs亞型p300的mRNA表達(dá)水平較對(duì)照組升高(P＜0.05)，而GCN5的表達(dá)水平與對(duì)照組相比沒(méi)有明顯的變化。
　　(4) AdBMP2轉(zhuǎn)染H9c2心肌細(xì)胞48h后，細(xì)胞核蛋白HATs活性較對(duì)照組明顯升高(P＜0.05)，總組蛋白H3乙?；揭草^對(duì)照組明顯上調(diào)(P＜0.05)，MEF2C、GATA

6、4啟動(dòng)子區(qū)組蛋白H3乙?；揭嘞鄳?yīng)升高（P＜0.05），但Tbx5啟動(dòng)子區(qū)組蛋白H3乙?；脚c對(duì)照組相比未見(jiàn)明顯變化。
　　結(jié)論：
　　(1) BMP2可上調(diào)H9c2心肌細(xì)胞中心臟核心轉(zhuǎn)錄因子MEF2C和GATA4的表達(dá)，而對(duì)Tbx5的表達(dá)沒(méi)有影響。
　　(2) BMP2可引起H9c2心肌細(xì)胞組蛋白H3高乙?；?，可能是H9c2心肌細(xì)胞組蛋白乙酰化修飾的上游信號(hào)通路之一。
　　(3) BMP2引起的H9c2心肌

7、細(xì)胞組蛋白H3高乙?；赡芘cHATs亞型p300有關(guān)。
　　(4) BMP2對(duì)MEF2C和GATA4啟動(dòng)子區(qū)組蛋白H3乙?；拇龠M(jìn)作用可能是BMP2引起MEF2C和GATA4表達(dá)上調(diào)的機(jī)制之一，而Tbx5啟動(dòng)子區(qū)組蛋白H3乙酰化未受BMP2的影響可能是Tbx5的表達(dá)不受BMP2調(diào)控的原因之一。
　　第二部分:p300參與BMP2對(duì)H9c2心肌細(xì)胞心臟核心轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)及組蛋白乙酰化修飾的調(diào)控作用。
　　目的：
　　

8、使用HATs亞型p300的抑制劑姜黃素(Curcumin)來(lái)研究p300在BMP2致H9c2心肌細(xì)胞心臟核心轉(zhuǎn)錄因子GATA4和MEF2C高表達(dá)及組蛋白高乙?；械淖饔?，以證實(shí)我們的科學(xué)假設(shè):p300參與BMP2對(duì)H9c2心肌細(xì)胞心臟核心轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)及組蛋白乙?；揎椀恼{(diào)控作用。
　　方法：
　　(1) AdBMP2轉(zhuǎn)染H9c2心肌細(xì)胞后，用不同濃度的p300 HAT活性抑制劑姜黃素(10μM，20μM，30μM，40μM)

9、處理細(xì)胞(6h，12h，24h，48h)，比色法檢測(cè)各處理組細(xì)胞HATs活性，篩選姜黃素最佳處理濃度及時(shí)間。
　　(2) AdBMP2和/或姜黃素處理H9c2心肌細(xì)胞后，Real-Time qRT-PCR檢測(cè)各處理組細(xì)胞心臟核心轉(zhuǎn)錄因子GATA4、MEF2C和Tbx5及HATs亞型p300和GCN5的表達(dá)水平，Western-blotting檢測(cè)各處理組細(xì)胞總組蛋白H3的乙?；剑珻hIP-Real-Time qPCR檢測(cè)各處理

10、組細(xì)胞GATA4、MEF2C和Tbx5啟動(dòng)子區(qū)組蛋白H3乙?；?。
　　結(jié)果：
　　(1)不同濃度(10μM，20μM，30μM，40μM)的姜黃素處理細(xì)胞24h后，H9c2心肌細(xì)胞的HATs活性明顯下降(P＜0.05)，并于40μM達(dá)到最低點(diǎn)。40μM姜黃素分別處理細(xì)胞6h，12h，24h，48h后，HATs活性于處理后12h達(dá)到最低點(diǎn)。
　　(2) AdBMP2和姜黃素共同處理H9c2心肌細(xì)胞后，心臟核心轉(zhuǎn)錄因子

11、GATA4和MEF2C及HATs亞型p300的mRNA表達(dá)水平較單獨(dú)AdBMP2處理組明顯下降（P＜0.05），而Tbx5及GCN5的mRNA表達(dá)水平在各處理組之間沒(méi)有明顯的變化。
　　(3) AdBMP2與姜黃素共同處理H9c2心肌細(xì)胞后，細(xì)胞中總組蛋白H3乙酰化水平及GATA4和MEF2C啟動(dòng)子區(qū)組蛋白H3乙?；捷^單獨(dú)AdBMP2處理組明顯下降(P＜0.05)，而Tbx5啟動(dòng)子區(qū)組蛋白H3乙?；诟魈幚斫M之間沒(méi)有明顯的變化

12、。
　　結(jié)論：
　　(1)姜黃素可抑制HATs亞型p300的表達(dá)，而對(duì)GCN5的表達(dá)沒(méi)有影響。
　　(2)在H9c2心肌細(xì)胞中，p300 HAT活性抑制劑姜黃素可拮抗BMP2引起的組蛋白H3高乙?；癎ATA4和MEF2C的高表達(dá)，說(shuō)明p300參與BMP2對(duì)H9c2心肌細(xì)胞GATA4和MEF2C表達(dá)及組蛋白乙?；恼{(diào)控。
　　(3)在H9c2心肌細(xì)胞中，Tbx5啟動(dòng)子區(qū)組蛋白H3乙酰化及其表達(dá)可能不受p300的調(diào)

13、控。
　　第三部分:BMPs參與介導(dǎo)氧化應(yīng)激反應(yīng)所致H9c2心肌細(xì)胞組蛋白高乙?；饔?。
　　目的：
　　使用BMPs信號(hào)通路抑制劑dorsomorphin(DM)來(lái)研究BMPs在氧化應(yīng)激反應(yīng)所致H9c2心肌細(xì)胞組蛋白高乙?；械淖饔茫宰C實(shí)我們的科學(xué)假設(shè):BMPs參與介導(dǎo)氧化應(yīng)激反應(yīng)所致H9c2心肌細(xì)胞組蛋白高乙?；?br>　　方法：
　　(1)不同濃度H2O2(50μM、100μM、150μM、200μM、

14、250μM、300μM、350μM、400μM)處理H9c2心肌細(xì)胞，24h后采用MTT法檢測(cè)各處理組細(xì)胞的存活率。
　　(2)5μM的BMPs信號(hào)通路抑制劑DM和/或適宜濃度的H2O2處理細(xì)胞，Real-Time qRT-PCR檢測(cè)各處理組細(xì)胞BMP2及心臟核心轉(zhuǎn)錄因子GATA4，MEF2C和Tbx5的表達(dá)水平，Western-blotting檢測(cè)各處理組細(xì)胞總組蛋白H3的乙?；健?br>　　結(jié)果：
　　(1)50、1

15、00和150μM濃度的H2O2對(duì)H9c2心肌細(xì)胞的存活率沒(méi)有明顯的影響，200、250、300、350、400和450μM濃度的H2O2處理H9c2心肌細(xì)胞后，細(xì)胞的存活率分別降低10.5％、16.9％、21.9％、32.4％、47.0％和58.6％。
　　(2)400μM H2O2處理H9c2心肌細(xì)胞后，BMP2、GATA4、MEF2C和Tbx5的mRNA表達(dá)水平較空白對(duì)照組明顯升高(P＜0.05)，細(xì)胞組蛋白H3的乙?；揭?/p>

16、相應(yīng)升高（P＜0.05）。
　　(3)400μM H2O2和DM共同處理H9c2心肌細(xì)胞后，H9c2心肌細(xì)胞中總組蛋白H3乙酰化水平較單獨(dú)400μM H2O2處理組有所下降(P＜0.05)，GATA4和Tbx5的mRNA表達(dá)水平也較單獨(dú)400μM H2O2處理組有所降低(P＜0.05)，而MEF2C的mRNA表達(dá)水平較單獨(dú)400μM H2O2處理組有所升高(P＜0.05)。
　　結(jié)論：
　　(1)利用H2O2成功構(gòu)建H

17、9c2心肌細(xì)胞氧化損傷模型。
　　(2)400μM H2O2引起的氧化應(yīng)激可上調(diào)H9c2心肌細(xì)胞BMP2、GATA4、MEF2C和Tbx5的表達(dá)并引起細(xì)胞組蛋白H3高乙?；?。
　　(3) BMPs信號(hào)通路抑制劑DM對(duì)400μM H2O2引起的氧化應(yīng)激所致H9c2心肌細(xì)胞組蛋白H3高乙?；癎ATA4和Tbx5表達(dá)上調(diào)具有一定的拮抗作用，說(shuō)明BMPs（BMP2及其它BMPs亞型）參與介導(dǎo)氧化應(yīng)激引起的心肌細(xì)胞組蛋白高乙?；癎