Smad4介導(dǎo)TGF-β2-BMP2信號(hào)對(duì)心臟發(fā)育相關(guān)基因組蛋白乙?；揎椪{(diào)控作用.pdf

1、本研究分為三部分：
　　第一部分:Smad4低表達(dá)對(duì)H9C2心肌細(xì)胞心臟發(fā)育相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)及其組蛋白乙?；揎椀挠绊?br>　　目的：
　　構(gòu)建Smad4低表達(dá)的細(xì)胞模型，檢測(cè)Smad4對(duì)心臟核心轉(zhuǎn)錄因子GATA4，MEF2c，Tbx5，Nkx2.5的表達(dá)的影響，并檢測(cè)其對(duì)組蛋白H3乙?；斑@些基因啟動(dòng)子區(qū)組蛋白H3乙?；降挠绊?。以證實(shí)我們的科學(xué)假設(shè): Smad4對(duì)組蛋白乙?；揎椌哂姓{(diào)節(jié)作用。
　　方法：

2、>　　(1)構(gòu)建3條低表達(dá)Smad4的慢病毒載體，轉(zhuǎn)染H9C2心肌細(xì)胞建立Smad4干擾的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株，然后從蛋白水平檢測(cè)Smad4蛋白的表達(dá)，檢測(cè)其干擾效果，篩選出干擾效果最好的細(xì)胞株進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。
　　(2)實(shí)驗(yàn)分為正常對(duì)照組，陰性對(duì)照組（空載慢病毒組）和Smad4干擾組，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)三組心臟發(fā)育相關(guān)基因GATA4，NKX2.5，MEF2c，Tbx5，以及組蛋白乙?；福℉ATs）亞型p300和GCN5的mRNA表達(dá)情

3、況，Western-blotting檢測(cè)乙?；M蛋白H3(acH3)的表達(dá)，ChIP-Real-Time Q-PCR檢測(cè)各處理組細(xì)胞GATA4，Nkx2.5，MEF2c，Tbx5啟動(dòng)子區(qū)組蛋白H3乙酰化水平。
　　結(jié)果：
　　(1)用第2條干擾序列包裝成的Smad4干擾慢病毒轉(zhuǎn)染H9C2心肌細(xì)胞以后，Smad4蛋白表達(dá)水平明顯下降，抑制率為86.8％。
　　(2)與正常對(duì)照組及陰性對(duì)照組相比，Smad4干擾組的心臟核心

4、轉(zhuǎn)錄因子GATA4，Nkx2.5表達(dá)降低(P＜0.05)，MEF2c，Tbx5以及HATs亞型p300和GCN5的表達(dá)無(wú)明顯變化。
　　(3)與對(duì)照組相比，Smad4干擾組心臟核心轉(zhuǎn)錄因子GATA4，Nkx2.5啟動(dòng)子區(qū)組蛋白H3乙?；浇档?，MEF2c，Tbx5無(wú)明顯變化。Smad4干擾組心肌細(xì)胞總體的組蛋白H3乙酰化水平無(wú)明顯變化。
　　結(jié)論：
　　(1)成功構(gòu)建了針對(duì)H9C2心肌細(xì)胞中干擾Smad4基因表達(dá)的慢

5、病毒載體，為后續(xù)試驗(yàn)中驗(yàn)證Smad4的關(guān)鍵作用奠定基礎(chǔ)。
　　(2) GATA4和Nkx2.5啟動(dòng)子區(qū)組蛋白H3乙?；浇档涂赡軐?dǎo)致GATA4和Nkx2.5的mRNA表達(dá)下降，而Smad4表達(dá)水平降低可能是導(dǎo)致GATA4，Nkx2.5啟動(dòng)子區(qū)乙酰化水平降低的機(jī)制之一。
　　第二部分: Smad4介導(dǎo)BMP2信號(hào)通路對(duì)心肌細(xì)胞組蛋白乙酰化修飾的調(diào)控作用及其機(jī)制研究
　　目的：
　　在阻斷Smad4基因表達(dá)的基礎(chǔ)上

6、，激活其上游的信號(hào)分子BMP2，觀(guān)察BMP2對(duì)下游心臟發(fā)育相關(guān)基因及乙酰化水平的影響，從而驗(yàn)證我們的科學(xué)假說(shuō):Smad4介導(dǎo)了BMP2對(duì)心臟發(fā)育相關(guān)組蛋白乙?；揎椀恼{(diào)節(jié)作用。
　　方法：
　　(1)用腺病毒AdBMP2轉(zhuǎn)染H9c2心肌細(xì)胞24h，48h，72h后，檢測(cè)BMP2下游基因GATA4，Nkx2.5的表達(dá)，篩選合適的作用時(shí)間點(diǎn)。
　　(2)選擇好合適的時(shí)間點(diǎn)后，用腺病毒AdBMP2和AdGFP分別轉(zhuǎn)染H9c2

7、空白組(Blank組)，陰性對(duì)照組(NC組)以及Smad4干擾慢病毒組（Lv-Smad4組），檢測(cè)心臟核心轉(zhuǎn)錄因子GATA4，MEF2c，Nkx2.5，Tbx5，以及HATs亞型p300，GCN5的mRNA表達(dá)情況。
　　(3)檢測(cè)心肌細(xì)胞總的組蛋白H3乙?；健?br>　　(4)檢測(cè)心臟核心轉(zhuǎn)錄因子GATA4，MEF2c，Nkx2.5，Tbx5啟動(dòng)子區(qū)的組蛋白H3的乙?；?。
　　結(jié)果：
　　(1) AdBMP2

8、分別轉(zhuǎn)染H9c2心肌細(xì)胞24h、48h、72h后，心臟核心轉(zhuǎn)錄因子Nkx2.5和GATA4的mRNA表達(dá)水平較對(duì)照組明顯升高(P＜0.05)，并于轉(zhuǎn)染后48h達(dá)到高峰。
　　(2)在Smad4低表達(dá)的心肌細(xì)胞中轉(zhuǎn)染AdBMP2后，與單獨(dú)AdBMP2轉(zhuǎn)染組相比，GATA4，Nkx2.5以及HATs亞型p300的mRNA表達(dá)量下降(P＜0.05)，而MEF2c，Tbx5的mRNA表達(dá)未受影響。GCN5的mRNA表達(dá)水平在各個(gè)處理組間無(wú)

9、明顯變化。
　　(3) AdBMP2處理組可提高心肌細(xì)胞總體組蛋白H3乙酰化水平，在Smad4低表達(dá)的心肌細(xì)胞中轉(zhuǎn)染AdBMP2后，與單獨(dú)AdBMP2處理組相比總組蛋白H3乙酰化水平下降。
　　(4) AdBMP2轉(zhuǎn)染Smad4低表達(dá)后的心肌細(xì)胞，與單獨(dú)AdBMP2處理組相比，GATA4，Nkx2.5的基因啟動(dòng)子區(qū)的組蛋白H3乙?；矫黠@下降(P＜0.05)，MEF2C，Tbx5啟動(dòng)子區(qū)組蛋白H3乙?；絼t無(wú)明顯差別。<

10、br>　　結(jié)論：
　　(1) BMP2可促進(jìn)心臟發(fā)育相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子GATA4，MEF2C，Nkx2.5，Tbx5的mRNA表達(dá)量。
　　(2) BMP2可以提高H9c2心肌細(xì)胞總的組蛋白H3乙酰化水平，在Smad4低表達(dá)以后，BMP2對(duì)組蛋白H3乙酰化水平上調(diào)作用受到限制，提示在BMP2引起的組蛋白修飾中，Smad4具有關(guān)鍵作用。
　　(3) BMP2可以提高組HATs亞型p300的表達(dá)，并且可通過(guò)提高GATA4，MEF

11、2c，Nkx2.5，Tbx5啟動(dòng)子區(qū)的乙?；綇亩岣哌@些基因的表達(dá)。而在此基礎(chǔ)上將Smad4低表達(dá)后，HATs亞型p300，以及GATA4，Nkx2.5基因啟動(dòng)子區(qū)組蛋白H3乙?；郊捌浠虻谋磉_(dá)水平均較單獨(dú)AdBMP2處理組均有下降，說(shuō)明HATs亞型p300可能參與了BMP2對(duì)心臟核心轉(zhuǎn)錄因子GATA4，Nkx2.5啟動(dòng)子區(qū)組蛋白H3乙?；降男揎椬饔茫鳶mad4可能介導(dǎo)BMP2對(duì)p300的調(diào)控作用，而MEF2c，Tbx5的

12、表達(dá)水平及乙?；讲⑽词艿絊mad4低表達(dá)的干擾，提示還可能存在其他分子介導(dǎo)這一過(guò)程。
　　第三部分 Smad4介導(dǎo)TGF-β2信號(hào)通路對(duì)心肌細(xì)胞組蛋白乙酰化修飾的調(diào)控作用及其機(jī)制研究
　　目的：
　　在阻斷Smad4基因表達(dá)的基礎(chǔ)上，激活其上游的信號(hào)分子TGF-β2，觀(guān)察TGF-β2對(duì)下游心臟發(fā)育相關(guān)基因及乙?；降挠绊?，從而驗(yàn)證我們的科學(xué)假說(shuō):Smad4介導(dǎo)了TGF-β2對(duì)心臟發(fā)育相關(guān)組蛋白乙酰化修飾的調(diào)節(jié)作用

13、。
　　方法：
　　(1)用不同濃度(5μg/L，10μg/L，20μg/L，40μg/L)的人重組轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子rhTGF-β2干預(yù)H9C2心肌細(xì)胞24h，48h，72h，提取細(xì)胞總RNA檢測(cè)TGF-β2下游基因GATA4，MEF2c的mRNA表達(dá)，篩選合適的濃度與時(shí)間。
　　(2)用重組生長(zhǎng)因子TGF-β2分別干預(yù)H9C2空白組，陰性對(duì)照組，Smad4干擾組細(xì)胞，檢測(cè)心臟核心轉(zhuǎn)錄因子GATA4，MEF2c,Nkx2.

14、5，Tbx5，以及乙?；竝300，GCN5的mRNA表達(dá)情況。
　　(3) WB方法檢測(cè)心肌細(xì)胞總的組蛋白H3乙?；健?br>　　(4)染色質(zhì)免疫沉淀(CHIP)方法檢測(cè)心臟發(fā)育相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子GATA4，MEF2c，Nkx2.5，Tbx5啟動(dòng)子區(qū)的組蛋白H3乙酰化水平。
　　結(jié)果：
　　(1)與對(duì)照組相比，經(jīng)TGF-β2干預(yù)后的心肌細(xì)胞，GATA4和MEF2c的mRNA表達(dá)量明顯增加(P＜0.05)，且在48小時(shí)，

15、20μg/L時(shí)達(dá)到峰值。
　　(2)TGF-β2干預(yù)Smad4低表達(dá)的H9c2心肌細(xì)胞后，與單獨(dú)TGF-β2干預(yù)組相比，GATA4，Nkx2.5的mRNA表達(dá)量下降(P＜0.05)，MEF2c的表達(dá)在這兩組間無(wú)明顯變化，而Tbx5，乙?；竝300和GCN5的mRNA表達(dá)水平在各個(gè)處理組間均無(wú)明顯變化。
　　(3) TGF-β2可提高心肌細(xì)胞總體組蛋白H3乙?；健＝?jīng)慢病毒Smad4干擾處理后的心肌細(xì)胞，再過(guò)表達(dá)TGF-β

16、2后，與單獨(dú)TGF-β2處理組相比，心肌細(xì)胞總的組蛋白H3乙?；较陆?。
　　(4)TGF-β2干預(yù)Smad4低表達(dá)的H9c2心肌細(xì)胞后，與單獨(dú)TGF-β2干預(yù)組相比，GATA4，Nkx2.5的基因啟動(dòng)子區(qū)的組蛋白H3乙?；矫黠@下降(P＜0.05)，MEF2c啟動(dòng)子區(qū)域乙?；皆趦山M之間差異不大，Tbx5在各組間的表達(dá)沒(méi)有變化。
　　結(jié)論：
　　(1)TGF-β2可促進(jìn)心臟發(fā)育相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子GATA4，MEF2C

17、，Nkx2.5的表達(dá)，對(duì)Tbx5及乙?；竝300，GCN5表達(dá)沒(méi)有影響。
　　(2)TGF-β2可以提高細(xì)胞總體組蛋白H3乙酰化水平，但用TGF-β2處理Smad4低表達(dá)的細(xì)胞后，總的組蛋白H3乙?；讲辉偕?，提示在TGF-β2參與的組蛋白修飾中Smad4起到了關(guān)鍵作用。
　　(3) TGF-β2通過(guò)提高GATA4，MEF2c，Nkx2.5啟動(dòng)子區(qū)的組蛋白H3乙?；綇亩岣哌@些基因的表達(dá)，但是TGF-β2引起的GA