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文檔簡介
1、GATA2屬于鋅指類轉(zhuǎn)錄因子GATA家族成員之一。該蛋白廣泛表達于造血干細胞(HSCs),參與調(diào)控HSCs增殖、分化與自我更新等生理功能。TGFβ信號通路是參與細胞生長、分化、增殖及腫瘤生成等多種生理病理學過程的重要信號通路,同時參與了HSCs的自我更新過程。Smad4是TGFβ通路中重要的節(jié)點分子,能夠與其他Smads家族成員結(jié)合,介導細胞外信號傳遞至細胞核,并且調(diào)節(jié)下游靶基因的表達。實驗室前期利用大規(guī)模酵母雙雜交技術(shù)發(fā)現(xiàn)GATA2與
2、Smad4具有高度可信相互作用,進一步研究驗證了GATA2與Smad4相互作用確實存在,并且共定位于細胞核,但GATA2與Smad4相互作用的意義以及機制并不明確。因此本研究利用外源性免疫共沉淀實驗驗證了GATA2與Samd4存在相互作用。利用熒光素酶報告基因?qū)嶒?證明了GATA2能夠抑制Smad4及其家族成員中R-Smads的轉(zhuǎn)錄活性;K562細胞中過表達GATA2,能夠抑制內(nèi)源性Smad4的轉(zhuǎn)錄活性;同時GATA2能夠抑制TGFβ通
3、路下游靶基因PAI-1的表達。上述實驗表明,GATA2通過抑制Smad4的轉(zhuǎn)錄活性,從而抑制TGFβ通路。利用實驗室前期根據(jù)GATA2結(jié)構(gòu)域所構(gòu)建的不同缺失體進行熒光素酶報告基因檢測,證明 GATA2對Smad4的抑制作用是通過其結(jié)構(gòu)域中的N端及其鋅指結(jié)構(gòu)。本研究驗證了TGFβ因子刺激能夠抑制Huh7細胞的增殖。通過構(gòu)建GATA2慢病毒表達載體,包裝慢病毒并建立GATA2過表達的Huh7穩(wěn)定細胞系,證明GATA2能夠抑制Huh7細胞對T
4、GFβ刺激的敏感性。為進一步在HSCs細胞中檢測GATA2功能及作用機制,構(gòu)建了人GATA2的慢病毒RNAi干涉載體,并對慢病毒進行了包裝,獲得了GATA2 RNAi慢病毒顆粒,建立了K562,TF-1的siGATA2穩(wěn)定細胞系,為后續(xù)的研究打下良好的基礎(chǔ)。GATA2通過與Smad4發(fā)生相互相互作用,發(fā)揮轉(zhuǎn)錄抑制活性,從而負調(diào)控TGFβ信號通路,并且抑制下游靶基因的表達。GATA2對TGFβ信號通路的負調(diào)控作用可能在造血干細胞的自我更新
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