RAGE和SLP76相互作用介導(dǎo)的下游信號通路的研究.pdf

1、隨著生活水平的提高、生活方式的改變和人口的老齡化,糖尿病患病率呈現(xiàn)出世界性的上升趨勢,成為繼心腦血管疾病、腫瘤之后的第三位嚴(yán)重危害大眾健康的慢性非傳染性疾病。糖尿病及其并發(fā)癥在許多國家已成為致死、致殘的主要因為之一,有研究發(fā)現(xiàn)由糖尿病慢性血管并發(fā)癥——動脈粥樣硬化導(dǎo)致的死亡率占糖尿病患者總死亡率的80％左右。單核巨噬細胞參與到糖尿病血管并發(fā)癥動脈粥樣硬化的整個過程中,其中包括泡沫細胞和動脈粥樣硬化斑塊的形成,外周血中的單核細胞粘附于內(nèi)皮

2、細胞并遷移到內(nèi)皮下間隙,攝取脂質(zhì)轉(zhuǎn)化為泡沫細胞是動脈粥樣硬化形成的重要早期事件。同時,大量研究表明晚期糖基化終末產(chǎn)物(advanced glycation end products,AGEs)在脈管系統(tǒng)的大量積聚在糖尿病血管并發(fā)癥中發(fā)揮著重要作用。血液和組織中的蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等生物大分子長期暴露在高糖基質(zhì)環(huán)境中發(fā)生了非酶性變的麥拉德反應(yīng)(Maillardreaction),最終導(dǎo)致AGEs的不可逆性形成。AGEs主要通過與血管細胞膜表面的

3、AGEs受體——晚期糖基化終末產(chǎn)物受體(receptor for advanced glycation endproducts.RAGE)結(jié)合后,激活細胞內(nèi)多條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,進而發(fā)揮其病理功能。
　　 RAGE是細胞膜表面免疫球蛋白超家族跨膜受體的成員之一,能夠與多種配體結(jié)合,其配體除AGEs和β樣片層蛋白外,還包括S100蛋白家族的一些成員(如S100B、S100P、S100A4、S100A6、S100A8/9、S100A11

4、-13)、高遷移率族蛋白1(high mobility group box protein1,HMGB1)和朊病毒蛋白分子。RAGE與配體的結(jié)合能夠引起細胞內(nèi)生物學(xué)功能的關(guān)鍵性改變,其中包括細胞增殖、遷移和炎性介質(zhì)的產(chǎn)生,介導(dǎo)細胞內(nèi)的應(yīng)急損傷和應(yīng)答反應(yīng),從而參與包括糖尿病慢性并發(fā)癥、腫瘤、動脈粥樣硬化、關(guān)節(jié)炎和神經(jīng)退行性病變等一系列疾病的病理過程。盡管目前對于AGEs與RAGE結(jié)合引起多條信號通路的報道很多,但是直接關(guān)于RAGE受體下游

5、近端信號事件的研究卻很少。RAGE短小的胞內(nèi)段在這些依賴RAGE的信號通路中起到了關(guān)鍵性的作用,但是目前對于胞內(nèi)段所參與或激活的胞漿內(nèi)信號通路的具體分子機制還沒有報道。我們實驗室在前期工作中運用T7噬菌體展示技術(shù)從人肺cDNA文庫中篩選到與RAGE胞內(nèi)段相互作用的12種蛋白,含有SH2結(jié)構(gòu)域的76 kDa的白細胞蛋白(SH2domain-containing leukocyte protein of76kDa,SLP76)就是其中之一。

6、
　　 SLP76是血源性細胞所特有的一種接頭蛋白,含有533個氨基酸,包括三個結(jié)構(gòu)域:即含SAM結(jié)構(gòu)域和三個酪氨酸磷酸化基序的酸性氨基末端、中間的富含脯氨酸結(jié)構(gòu)域和羧基末端的SH2結(jié)構(gòu)域。SLP76主要表達在造血系統(tǒng)和血小板、中性粒細胞、肥大細胞、巨噬細胞、自然殺傷細胞及未成熟B細胞中,其在T細胞受體相關(guān)的信號通路及血小板凝血功能方面起到了重要作用。在細胞內(nèi)SLP76可以和多種蛋白相互作用,包括能磷酸化SLP76的SYK家族激

7、酶中的70 kDa的T細胞受體Zeta鏈相關(guān)蛋白激酶(the SYK-family kinaseζ-chain-associated protein kinase of70 kDa,ZAP70)、激活T細胞的跨膜接頭蛋白(the adaptor proteins of linker for activation of T cells,LAT)、磷脂酶Cγ1(phospholipase Cγ1,PLCγ1)、鳥嘌呤核苷酸交換因子VAV和生

8、長因子受體結(jié)合蛋白2(Grb2-related adaptor downstream of Shc,Grb2)等一些蛋白分子,它們共同組成接頭蛋白復(fù)合體參與到多條信號通路中。
　　 基于上述認(rèn)識,我們提出以下假設(shè):當(dāng)AGEs和RAGE結(jié)合后,RAGE胞內(nèi)段通過與由SLP76參與構(gòu)成的接頭蛋白復(fù)合體相互作用,再由復(fù)合體中的Grb2將信號傳遞給Ras,Ras可以激活下游的絲裂原活化蛋白激酶激酶激酶Raf,信號由高度保守的三級激酶模式

9、向下游傳遞,進而觸動細胞內(nèi)的氧化應(yīng)激并導(dǎo)致核轉(zhuǎn)錄因子(nuclear factor-κ-gene binding,NF—κB)的活化,使得效應(yīng)細胞細胞因子表達量發(fā)生變化,產(chǎn)生相應(yīng)的病理學(xué)效應(yīng)。如果上述假設(shè)能夠得到證實,對闡明RAGE和SLP76相互作用在細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中的作用具有重要意義,并且能夠以RAGE和SLP76相互作用為切入點揭示糖尿病血管并發(fā)癥動脈粥樣硬化的發(fā)病機制,為其尋找臨床治療方案提供依據(jù)。前期的體內(nèi)、體外結(jié)合實驗均已

10、證實RAGE與SLP76兩者之間存在相互作用,同時證實這種相互作用具有刺激依賴性。通過對SLP76各結(jié)構(gòu)域及磷酸化位點的功能性研究發(fā)現(xiàn),在RAGE和SLP76過表達的HEK293細胞模型中,SLP76的第145位、第173位酪氨酸以及第207位絲氨酸位點的突變和SAM結(jié)構(gòu)域缺失突變對RAGE-SLP76相互作用有影響。
　　 基于實驗室前期工作和以上認(rèn)識,本研究對RAGE和SLP76相互作用介導(dǎo)的下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活情況進行了

11、初步研究。研究包括以下兩個部分:
　　 第一部分:RAGE和SLP76相互作用介導(dǎo)的下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的研究
　　 1.首先,為明確RAGE和SLP76是否參與到MAPK信號通路的活化過程,我們將外源性的質(zhì)粒pcDNA3-HA-RAGE和pcDNA3-Flag-SLP76共轉(zhuǎn)染到RAGE和SLP76表達缺陷的HEK293細胞,并設(shè)立轉(zhuǎn)染空載體組和單轉(zhuǎn)染組作為對照,選取實驗室前期工作中證明的RAGE和SLP76相互作用活化M

12、APK最強的時間點10 min作為AGEs的刺激時間,檢測細胞內(nèi)MAPK信號通路的激活情況,這為確定RAGE和SLP76是否參與到MAPK信號通路的活化過程中提供了依據(jù),結(jié)果發(fā)現(xiàn),RAGE和SLP76均參與到ERK的活化過程中。
　　 2.既然SLP76參與了ERK的活化過程,前期工作通過對SLP76各結(jié)構(gòu)域及磷酸化位點的功能性研究發(fā)現(xiàn):SLP76的第145位、第173位酪氨酸以及第207位絲氨酸位點的突變和SAM結(jié)構(gòu)域缺失突變

13、對RAGE-SLP76相互作用有影響。那么SLP76第145位酪氨酸、第173位酪氨酸及第207位絲氨酸位點的突變和SAM結(jié)構(gòu)域缺失對ERK的活化又會產(chǎn)生什么影響呢?我們將pcDNA3-HA—RAGE和SLP76的四種突變體共轉(zhuǎn)染HEK293細胞,并設(shè)立轉(zhuǎn)染空載體組、單轉(zhuǎn)染組和pcDNA3-HA-RAGE和pcDNA3-Flag-SLP76共轉(zhuǎn)染組作為對照,然后給予AGEs刺激10 min,檢測細胞內(nèi)MAPK信號通路的激活情況,結(jié)果發(fā)現(xiàn)

14、SLP76第145位酪氨酸、第173位酪氨酸及第207位絲氨酸位點的突變對ERK的活化有影響,而SAM結(jié)構(gòu)域缺失突變對ERK的活化無影響。
　　 3.RAGE和SLP76在單核巨噬細胞系統(tǒng)皆有表達,這是兩者發(fā)生相互作用并介導(dǎo)信號通路激活的物質(zhì)基礎(chǔ)和客觀條件,而單核巨噬細胞又是炎癥反應(yīng)的重要參與者,因此為了進一步明確細胞中內(nèi)源性的RAGE和SLP76相互作用的生物學(xué)效應(yīng),接下來我們用AGEs刺激RAW264.7細胞,檢測細胞內(nèi)MA

15、PKs家族信號通路的激活情況。首先采用免疫印跡western blot研究RAGE和SLP76相互作用介導(dǎo)的下游MAPK信號通路激活的時間效應(yīng)。實驗設(shè)立AGEs刺激RAW264.7細胞0 min、1 min、2 min、5 min、10 min、15 min、30 min和60 min組,western blot檢測了細胞內(nèi)MAPK信號通路的激活情況,結(jié)果發(fā)現(xiàn)ERK和p38均能被激活,且具有不同的時間效應(yīng),而JNK在刺激前后激活現(xiàn)象不明

16、顯。既然ERK和p38均能被激活,為了進一步探討其下游信號通路的激活情況,設(shè)立了AGEs刺激RAW264.7細胞0 min、10 min、60 min、90 min、120 min和240min組,再采用western blot分析NF-κB通路的激活情況,結(jié)果顯示IKKα/β在AGEs刺激10 min就開始激活,一直持續(xù)到4 h。為分析調(diào)控AGEs所激活MAPK通路中的上游激酶,接下來我們用ERK1/2激酶抑制劑PD98059預(yù)處理細

17、胞,然后再給予AGEs刺激,western blot檢測了細胞內(nèi)MAPK信號通路受抑制情況,結(jié)果顯示40μM的PD98059能完全抑制ERK的磷酸化激活；最后利用LiquiChip-液相芯片技術(shù)檢測AGEs刺激下細胞因子表達譜的變化情況,從而初步探討了RAGE和SLP76相互作用介導(dǎo)的下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活情況,為深入研究這種信號通路的激活在糖尿病慢性并發(fā)癥等炎癥性疾病中的作用奠定了理論基礎(chǔ)。
　　 4.由以上結(jié)果可知,在pcD

18、NA3-HA-RAGE和pcDNA3-Flag-SLP76共轉(zhuǎn)染的HEK293細胞模型中,結(jié)果表明RAGE和SLP76均參與到ERK的活化過程中。同時,AGEs刺激能引起RAW264.7細胞內(nèi)MAPK信號通路中的ERK和p38的磷酸化現(xiàn)象增強,這種磷酸化增強現(xiàn)象是否是由RAGE和SLP76相互作用介導(dǎo)的呢?為進一步證實RAW264.7細胞內(nèi)源性RAGE和SLP76存在相互作用并參與MAPK信號通路的活化,我們用AGEs刺激RAW264.

19、7細胞1 min,2 min,5 min,10 min,15 min,30 min,60 min七個時間點,并設(shè)立不刺激組(0 min組)作為對照,裂解細胞收集細胞裂解液上清。用抗RAGE的抗體耦合蛋白G親和瓊脂糖珠進行免疫共沉淀,將沉淀下來的復(fù)合物經(jīng)SDS-PAGE電泳分離,然后分別采用抗RAGE抗體和抗SLP76抗體進行western blot檢測,分析RAGE和SLP76之間的相互作用。
　　 第二部分:沉默RAGE基因表

20、達的RNAi慢病毒載體的構(gòu)建及鑒定
　　 RAGE是免疫球蛋白超家族跨膜受體的成員之一,其在結(jié)構(gòu)上由三部分組成,即胞外段、跨膜段和只含有43個氨基酸的短小胞內(nèi)段,其中胞外段又包含三個免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域,即一個V型結(jié)構(gòu)域緊接兩個C型結(jié)構(gòu)域。通過對RAGE結(jié)構(gòu)功能的研究表明V型結(jié)構(gòu)域在結(jié)合配體方面起到重要作用,而短小的胞內(nèi)段在RAGE介導(dǎo)的細胞內(nèi)信號通路方面起到了關(guān)鍵性的作用,但是目前對于胞內(nèi)段所參與或激活的胞漿內(nèi)信號通路的具體分子

21、機制報道很少。我們希望借助慢病毒RNA干擾技術(shù),阻斷RAGE和SLP76的相互作用,這對于闡明兩者之間的相互作用介導(dǎo)的信號通路具有重要意義。
　　 RNA干擾(RNA interference,RNAi)是近年來發(fā)現(xiàn)的一種重要的基因沉默技術(shù),通過轉(zhuǎn)錄后的基因沉默方式(post-transcriptional gene silencing,PTGs)來沉默相應(yīng)基因的表達,由21-23個堿基組成的小干擾RNA(small inter

22、ference,siRNA)是關(guān)鍵性的作用分子,它可以特異性地與靶基因的mRNA結(jié)合導(dǎo)致相應(yīng)的mRNA降解,最終導(dǎo)致靶基因表達水平的降低,因此RNAi在研究基因的功能及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路方面具有良好的應(yīng)用前景。目前,用于沉默基因表達的RNA干擾技術(shù)主要有化學(xué)合成的siRNA、表達短發(fā)夾樣RNA(short hairpin,shRNA)的質(zhì)粒載體和表達shRNA的病毒載體,質(zhì)粒載體和病毒載體可以在宿主細胞內(nèi)持續(xù)穩(wěn)定的轉(zhuǎn)錄出shRNA,而shRN

23、A可以被內(nèi)源性的Dicer酶切割成siRNA雙鏈發(fā)揮RNAi作用。因此,與siRNA相比,質(zhì)粒載體和病毒載體可以長時間、穩(wěn)定的誘導(dǎo)基因沉默,在研究基因功能及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路方面具有更大的優(yōu)勢。慢病毒是以人類免疫缺陷Ⅰ型病毒(human immunodeficiency virus1,HIV-1)為基礎(chǔ)發(fā)展形成的一種病毒載體,對分裂細胞和非分裂細胞都具有很強的感染能力,并且慢病毒載體具有低免疫原性及基因整合率高等優(yōu)點,被廣泛用于RNAi和基因

24、表達的載體。
　　 我們利用Invitrogen在線軟件設(shè)計了三條RAGE基因shRNA序列,合成、退火形成雙鏈寡核苷酸(double strand oligo,dS oligo)后克隆到線性的pENTRTM/H1/TO載體的黏性末端,測序。得到的陽性重組子再與慢病毒載體進行重組反應(yīng),從而獲得RAGE基因的真核表達慢病毒干擾載體。在脂質(zhì)體的介導(dǎo)下將慢病毒包裝輔助復(fù)合體和RAGE基因的真核表達慢病毒載體導(dǎo)入293FT細胞包裝病毒,

25、測定病毒滴度,感染PC-3細胞,檢驗其干擾RAGE基因表達的有效性。
　　 通過以上研究,我們得出以下幾點結(jié)論:
　　 1.RAGE和SLP76均參與了ERK的磷酸化激活,RAGE和SLP76的相互作用介導(dǎo)了ERK的活化過程。
　　 2.SLP76第145位酪氨酸、第173位酪氨酸及第207位絲氨酸位點的突變對ERK的活化有影響,而SAM結(jié)構(gòu)域缺失突變對ERK的活化無影響。
　　 3.內(nèi)源性的RAGE和S

26、LP76存在相互作用。在AGEs刺激下,能激活RAW264.7細胞內(nèi)的ERK和p38通路,而JNK在刺激前后不受影響。并且ERK和p38的激活具有不同的時間效應(yīng)。ERK在不刺激時有微弱磷酸化現(xiàn)象,AGEs刺激5 min時磷酸化開始明顯增強,10 min時磷酸化程度達高峰,此后一直持續(xù)在磷酸化高水平狀態(tài),60 min時磷酸化現(xiàn)象開始衰減。而對于p38,在不刺激時也有微弱的磷酸化現(xiàn)象,AGEs刺激1 min時磷酸化現(xiàn)象就明顯激活,此后一直持

27、續(xù)在磷酸化高水平狀態(tài),30 min時開始出現(xiàn)衰減。
　　 4.AGEs刺激RAW264.7細胞,亦能激活MAPK下游的NF-κB信號通路,其激活也具有一定的時間效應(yīng),10 min即到達高峰,這種激活狀態(tài)一直持續(xù)到6h；且AGEs刺激可引起RAW264.7細胞因子巨噬細胞炎性蛋白-1α(MacrophageInflammatory Protein-1 alpha,MIP-1α)和腫瘤壞死因子-α(tumor necrosisfac

28、tor-alpha,TNF-α)表達量的變化。
　　 5.ERK1/2激酶抑制劑PD98059能抑制AGEs刺激引起的ERK和NF-κB的激活。
　　 6.成功構(gòu)建了沉默RAGE基因表達的慢病毒入門載體和表達載體,并成功包裝出高滴度的慢病毒,其滴度達8.7×106 U/ml。并檢測了慢病毒能成功沉默PC-3細胞中RAGE基因的表達,為進一步探討在RAGE和SLP76相互作用所激活的信號通路中,RAGE的功能性研究奠定了基