TGFβ信號通路下游分子Smad3和Smad4相互作用蛋白網(wǎng)絡(luò)研究及功能初探.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、TGF β即轉(zhuǎn)化生長因子(transforming growth factor),是一類多功能的細胞因子,其信號途徑及相關(guān)功能也是近年來的研究熱點。以往的研究表明,TGF β與細胞的增殖、分化、遷移及凋亡有關(guān);在機體中參與了從炎癥反應(yīng)、組織修復(fù)到骨骼形成、胚胎發(fā)育等一系列重要的生物學(xué)過程;并與某些人類疾病的發(fā)生密切相關(guān)。特別是在肝臟中,該信號通路的異常與肝炎、肝纖維化、肝硬化以及肝癌都有密切關(guān)系。因此對于該通路的研究具有十分重要的生物學(xué)

2、意義;而對其各組分相互作用蛋白的研究將是闡明其功能及調(diào)控機制的關(guān)鍵所在。 本文采用高通量規(guī)模化的蛋白質(zhì)相互作用研究方法Y2H技術(shù),以TGFβ信號通路中的重要分子Smad2、3、4為誘餌,在正常成人肝臟cDNA文庫中進行相互作用蛋白的篩選。二個誘餌分子的篩選中,共獲得125個陽性克隆。經(jīng)過測序比對,排除非編碼序列及不符合閱讀框的序列后,得到二個誘餌的87個正確獵物克隆,匹配上32個基因共包含34個相互作用對。經(jīng)文獻調(diào)研,其中6對為

3、已知的相互作用,剩余28對即為本研究新發(fā)現(xiàn)的相互作用。 酵母回轉(zhuǎn)驗證中97%(33/34)的相互作用仍表現(xiàn)為陽性;隨機選取10對相互作用進行CO-IP,陽性率達到了100%,表明相互作用的可信度較高。采用生物信息學(xué)的方法,結(jié)合基因敲除信息對得到的相互作用進行了生物學(xué)相關(guān)性分析。結(jié)果顯示:66%的相互作用中獵物和誘餌具有相同的基因敲除表型;26%的獵物和誘餌具有基因共表達特性;26%的相互作用蛋白共享到GO中第六級功能注釋;56%

4、的相互作用從網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)學(xué)分析具有較高的可信度。最后整合相關(guān)參數(shù)的評分結(jié)果,對每一對相互作用給出總體評分:53%(18/34)的相瓦作用具有高可信度。 最后,將得到的相互作用以及整合了已知相互作用的數(shù)據(jù)進行可視化分析,構(gòu)建相互作里網(wǎng)絡(luò)圖,對篩選結(jié)果進行補充和拓展。結(jié)合報告基因?qū)嶒灲Y(jié)果,我們推測篩選到的Smads相互作用蛋白在TGFβ信號通路中可能具有重要的調(diào)控作用。USP7:去泛素化酶,調(diào)控Smads蛋白在細胞中的表達水平;PP

5、P1R12C:一種新的Smads蛋白去磷酸化途徑,參與TGFβ信號的活性調(diào)節(jié);SQSTM1:作為支架蛋白通過介導(dǎo)Smads與其它蛋白的相互作用發(fā)揮對該信號通路的調(diào)控作用;此外本文篩選到Smad4與NLK的相互作用,這提示W(wǎng)nffTGFβ信號通路可能具有新的交互聯(lián)絡(luò)方式。另外,本文對Smad3復(fù)合體的研究進行了初步探索,擬采用串聯(lián)親和純化的方法在肝臟相關(guān)細胞系中分離純化Smad3復(fù)合體進行質(zhì)譜鑒定。首先構(gòu)建了靶基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體,轉(zhuǎn)染包

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