DEDD與Smad3相互作用負(fù)性調(diào)控TGF-β介導(dǎo)的生物學(xué)活性.pdf

1、轉(zhuǎn)化生長因子β（TGF-β）是一類對(duì)細(xì)胞增殖、分化、遷移、凋亡以及細(xì)胞外基質(zhì)形成、血管形成、免疫、發(fā)育均發(fā)揮調(diào)節(jié)作用的分泌型細(xì)胞因子。該家族調(diào)節(jié)異常可以導(dǎo)致各種疾病發(fā)生，例如腫瘤、纖維化、自身免疫性疾病以及血管性疾病等。TGF-β家族發(fā)揮其生物學(xué)功能主要通過Smads蛋白，Smads是TGF-β家族細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)分子。目前在哺乳動(dòng)物中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)八種Smads蛋白，根據(jù)功能不同可分為三類：受體激活型Smads、通用介質(zhì)型Smads、抑制型S

2、mads。TGF-β信號(hào)在整個(gè)傳遞過程中均受到不同層面的調(diào)節(jié)，因此TGF-β家族具有生物功能多樣性。細(xì)胞內(nèi)多種蛋白都可與Smads相互作用，這可以促進(jìn)TGF-β信號(hào)與其他信號(hào)途徑發(fā)生“整合”。
　　 死亡受體結(jié)構(gòu)域（Death effector domains，DEDs）是蛋白發(fā)生相互作用的區(qū)域，含有DED的蛋白可以介導(dǎo)由死亡受體觸發(fā)的程序性細(xì)胞死亡或凋亡。DED本身沒有酶活性而是作為其他DEDs的結(jié)合區(qū)域，因而促進(jìn)蛋白復(fù)合體形

3、成。FADD、caspase8以及DEDD均屬于含有DED結(jié)構(gòu)域的蛋白。研究表明，DEDD通過活化caspase3或capase6在CD95介導(dǎo)的凋亡途徑中發(fā)揮重要作用。近來發(fā)現(xiàn)DEDD也參與細(xì)胞周期調(diào)控并抑制有絲分裂進(jìn)程。然而，關(guān)于DEDD是否通過與關(guān)鍵的蛋白相互作用參與其他信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑以及DEDD本身生物學(xué)功能尚未清楚。
　　 我們實(shí)驗(yàn)室前期以全長的Smad3蛋白為“釣餌”，通過酵母雙雜交系統(tǒng)篩選出DEDD與Smad3相互作

4、用。本次研究中，我們應(yīng)用免疫共沉淀和GST-pull down方法均證明DEDD與Smad3可以發(fā)生相互作用，這是首次報(bào)道Smad3與含有DED結(jié)構(gòu)域蛋白之間的相互作用。我們發(fā)現(xiàn)TGF-β可以下調(diào)DEDD與Smad3的結(jié)合，而且DEDD與磷酸化的Smad3結(jié)合能力減弱。雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)證明DEDD通過其DED結(jié)構(gòu)域可以抑制TGF-β/Smad3介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄活性，而且Smad3可以協(xié)同增強(qiáng)DEDD對(duì)NF-KB基因的轉(zhuǎn)錄。細(xì)胞免疫熒光染

5、色和Western blotting實(shí)驗(yàn)證明DEDD可以抑制Smad3入核作用。免疫沉淀實(shí)驗(yàn)證明DEDD可以抑制Smad3磷酸化以及Smad3與Smad4復(fù)合體形成作用。Western blotting和RT-PCR實(shí)驗(yàn)證明DEDD抑制TGF-β靶基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯，而且TGF-β抑制DEDD蛋白表達(dá)和基因轉(zhuǎn)錄。細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell實(shí)驗(yàn)證明DEDD抑制TGF-β介導(dǎo)的細(xì)胞遷移和侵襲作用，而且DEDD本身也具有抑制細(xì)胞遷移和侵襲