miR-145在硬皮病TGF-β-Smad3促纖維化通路中的作用及機制研究.pdf

1、研究背景：硬皮病是一種以廣泛纖維化、血管改變和免疫異常為主要特點的自身免疫性疾病。硬皮病最常累及皮膚,引起膠原生成增加、細胞外基質沉積增加。此外,還可累及肺臟、心臟、腎臟、消化道等內臟器官,導致肺間質纖維化、肺動脈高壓等嚴重并發(fā)癥,10年生存率約為60％～90％。由于其病因不明,暫無特效治療方法,特別是缺乏針對進行性纖維化的靶向治療。隨著對該病發(fā)病機制的深入研究,學者們認為細胞外基質生成增多是由成纖維細胞過度活化所致,在內皮細胞、淋巴細

2、胞、巨噬細胞等細胞的互相作用下,通過細胞因子、趨化因子和生長因子等多種介質,成纖維細胞過度活化,形成惡性循環(huán)。闡明硬皮病的發(fā)病機制對于了解臨床分型、指導治療、判斷預后至關重要。
　　皮膚和臟器進行性纖維化是硬皮病的主要病理生理過程,轉化生長因子(transforming growth factor,TGF)-β是其中的重要組成部分。TGF-β是成纖維細胞的強效趨化物,能使細胞外基質合成增多(如Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原等),使成纖維細胞合

3、成纖連蛋白增多,調節(jié)細胞-基質粘附蛋白受體,調節(jié)蛋白產(chǎn)生(如纖溶酶原激活物或膠原酶原)。通過自身誘導,TGF-β能刺激成纖維細胞合成TGF-β,上調TGF-β受體的表達。TGF-β持續(xù)生成增多,引起細胞外基質進行性沉積,進而導致纖維化。TGF-β主要通過Smad家族轉錄激活因子實現(xiàn)信號傳遞,其中Smad3與其關系最為密切。在活化的TGF-β刺激下,Smad3被TGF-β受體Ⅰ激酶磷酸化,繼而與Smad4結合形成復合物,進入細胞核,與Sm

4、ad結合元件及轉錄因子相互作用,誘導編碼細胞外基質的基因表達升高。
　　microRNAs(miRNAs)是近年發(fā)現(xiàn)的一類約為22個核苷酸的非編碼RNA分子,與mRNA3’端非翻譯區(qū)種子序列配對,主要負向調控基因表達。如果配對完全或接近完全,靶mRNA將被完全降解。如果配對不完全,則與靶mRNA形成復合物,抑制mRNA的翻譯。最近數(shù)年間發(fā)現(xiàn)的miRNA呈指數(shù)增長,由人類基因組編碼的miRNA目前已超過千種。miRNA與多種自身免疫

5、性疾病的發(fā)病相關,如系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類風濕關節(jié)炎、干燥綜合征和原發(fā)性膽汁性肝硬化。最新研究發(fā)現(xiàn),miRNA可能參與硬皮病發(fā)病機制,但其具體定位及其靶基因有待進一步探討。
　　miRNA芯片技術是一種高通量miRNA篩查方法,可檢測患者與正常對照中miRNA的差異表達。本研究擬采用miRNA芯片技術,篩選在硬皮病患者和正常人中差異表達的miRNAs,并通過生物信息學分析,尋找出與TGF-β/Smad促纖維化信號通路相關的miRNA,

6、并采用real-time PCR、免疫組化等試驗方法,從組織、細胞水平驗證目標miRNA及其靶基因在硬皮病發(fā)病中的作用。開展本研究,有望為闡明miRNA在硬皮病發(fā)病機制中的作用提供實驗依據(jù),并為研發(fā)特異性抗纖維化靶向治療提供目標miRNA。
　　第一部分 miRNA在硬皮病患者皮膚中的差異表達
　　目的：通過比較硬皮病患者與正常對照的miRNA表達譜,發(fā)現(xiàn)在硬皮病患者中具有差異表達的miRNAs。
　　方法：采集7例硬

7、皮病患者與7例對照者的臨床資料和皮膚樣本,進行組織病理檢查,并采用miRNA芯片技術分析具有差異表達的miRNAs。
　　結果：在7例硬皮病患者中,5例為彌漫性硬皮病,2例為局限性硬皮病,男性2例,女性5例,年齡為30～64歲,平均年齡49.0歲,平均病程16.6個月。對照組7例,其中男性4例,女性3例,年齡為21～58歲,平均年齡44.8歲。從硬皮病患者與對照者前臂取皮膚樣本,分別進行病理檢查、成纖維細胞培養(yǎng)和miRNA芯片分析

8、。硬皮病患者的皮膚病理檢查顯示膠原過度沉積和深部纖維化。經(jīng)miRNA芯片技術分析,發(fā)現(xiàn)在彌漫性硬皮病患者中,表達差異的miRNAs共有42個,其中25個表達上調,17個表達下降。在局限性硬皮病患者中,表達差異的miRNAs共有60個,其中42個表達上調,18個表達下降。21個miRNAs在彌漫性硬皮病和局限性硬皮病中均有表達差異,其中13個上調,8個下調。
　　結論：硬皮病患者與正常對照的皮膚組織具有不同的miRNAs表達譜。

9、r>　　第二部分 miR-145在硬皮病TGF-β/Smad3通路中的作用及機制研究
　　目的：探討miR-145在硬皮病TGF-β/Smad3通路中的作用及其機制。
　　方法：通過生物信息學方法篩選與TGF-β/Smad3通路相關的miRNA。采用real-time PCR檢測miR-145在硬皮病患者和正常對照者的皮膚組織和皮膚成纖維細胞中的表達,免疫組化、real-time PCR檢測Smad3蛋白和mRNA在硬皮病患

10、者和正常對照者的皮膚組織和皮膚成纖維細胞中的表達,real-time PCR檢測TGF-β刺激時硬皮病患者和正常對照者的皮膚成纖維細胞中miR-145和Smad3 mRNA的表達。
　　結果：經(jīng)過生物信息學分析,發(fā)現(xiàn)Smad3 mRNA中含有miR-145結合的種子序列。對正常對照相比,miR-145在硬皮病患者的皮膚組織和皮膚成纖維細胞中表達均顯著降低(P＜0.05),Smad3 mRNA在硬皮病皮膚組織和皮膚成纖維細胞中表達顯