LRP16相互作用蛋白的篩選及功能調(diào)控研究.pdf

1、目的：①應(yīng)用酵母雙雜交技術(shù)篩選人乳腺癌細胞MCF-7 cDNA文庫中可與LRP16相互作用的蛋白；②確認(rèn)LRP16與AR等核受體及NF-κB的相互作用；③研究LRP16對AR轉(zhuǎn)錄活性的調(diào)控作用及其對前列腺癌細胞系LNCap在不同濃度雄激素刺激下增殖的影響；④觀察雄激素對LRP16表達的調(diào)控作用。 方法：①pLPC-LRP16質(zhì)粒經(jīng)酶切、瓊脂糖凝膠電泳、回收，獲得LRP16的基因片段，將其連接至酵母雙雜交系統(tǒng)誘餌載體pGBKT7中

2、，經(jīng)酶切驗證其正確插入方向后，將重組誘餌質(zhì)粒轉(zhuǎn)化酵母菌AH109和Y187，并檢測其在酵母中有無自激活作用和毒性。隨后提取轉(zhuǎn)化后的酵母總蛋白，經(jīng)Western blot檢測誘餌質(zhì)粒在酵母中的表達情況，以鑒定其作為誘餌蛋白的可行性。②將誘餌質(zhì)粒pGBKT7-LRP16、MCF-7 ds cDNA文庫片段及線性化質(zhì)粒pGADT7-Rec共轉(zhuǎn)化酵母菌AH109，在營養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基(SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade)上篩選陽性菌落。

3、提取陽性克隆質(zhì)粒進行PCR，將PCR產(chǎn)物測序，并將酵母質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌Top10獲得與誘餌質(zhì)粒有相互作用的單個丈庫質(zhì)粒，測序后回復(fù)驗證其在酵母中的相互作用。③用免疫共沉淀(Co-IP)及GST pull-down等體內(nèi)、體外的方法驗證LRP16與AR-T-27的相互作用；進一步采用GST pull-down確認(rèn)LRP16與AR等核受體及NF-κB直接的相互作用，并驗證了LRP16與AR相互作用的結(jié)構(gòu)域；④熒光素酶報告基因檢測LRP

4、16對AR轉(zhuǎn)錄激活的影響及AR對LRP16啟動子的調(diào)控作用；⑤采用MTT檢測抑制內(nèi)源性LRP16在不同雄激素濃度刺激下對LNCap增殖的影響；⑥在不同濃度及不同作用時間點睪酮刺激下，用Western blot檢測LRP16蛋白表達水平的變化及在不同前列腺癌細胞系LRP16的表達情況。 結(jié)果：①重組誘餌質(zhì)粒經(jīng)酶切驗證，片段大小和插入方向均正確，將其轉(zhuǎn)化入酵母菌后無自激活作用和毒性，Western blot證實在酵母中重組誘餌質(zhì)?？?/p>

5、正確表達人LRP16蛋白；②獲得8個與LRP16相互作用的候選蛋白，選取4個在酵母中進行回復(fù)驗證，其中有3個可生長出陽性克??；③ART-27可與LRP16相互作用，且AR、ERβ、PPARα、PPARγ等核受體及NF-κB均與LRP16有直接的相互作用；④LRP16通過唯一的C端結(jié)構(gòu)域與AR的LBD域相互作用；⑤在睪酮的作用下，過表達LRP16對AR的轉(zhuǎn)錄活性有增強作用，抑制內(nèi)源性LRP16的表達可減弱AR的轉(zhuǎn)錄激活活性；⑥減少內(nèi)源性L

6、RP16表達可抑制不同雄激素水平下LNCap細胞的增殖；⑦低濃度的睪酮可使LRP16蛋白表達增多，睪酮作用3h即可使LRP16蛋白表達增多，且AR對LRP16啟動子活性存在增強作用；⑧AR陽性的前列腺癌細胞系LNCap比AR陰性的前列腺癌細胞系DU145中LRP16蛋白含量高。 結(jié)論：①應(yīng)用酵母雙雜交技術(shù)篩選出-族功能基本明確的可與LRP16相互作用的候選蛋白；②LRP16可與AR、NF-κB直接相互作用，且這種相互作用不依賴于