hPER1相互作用蛋白的篩選及與近日節(jié)律關系的研究.pdf

1、本研究的主要目的是尋找人腦組織cDNA文庫中與hPER1蛋白相互作用的新蛋白，完善Perl相關的近日節(jié)律鐘控系統(tǒng)的詳細機制和信號傳導通路。研究分為三個部分：1、人腦組織中與hPER1相互作用新蛋白的篩選與鑒定；2、新蛋白與hPER1相互作用的關鍵結構域的確定；3、新蛋白與hPER1的功能聯(lián)系的研究。 方法與結果： 第一部分：人腦cDNA文庫中與hPER1相互作用蛋白的篩選 方法：采用BD Clontech公司提供

2、的文庫構建試劑盒（BD Matchmaker<'TM>Library Construction & Screening Kits）構建人腦cDNA文庫。通過RT-PCR擴增hPER1-PAS結構域的編碼序列，獲得的片斷與質(zhì)粒載體pGBKT7連接重組為誘餌質(zhì)粒pGBKT7／hPer1<,PAS>。采用順序轉染法構建酵母雙雜交系統(tǒng)（MATCHMAKER GAL4 Two-Hybrid System，BD Clontech），篩選人腦cDNA

3、文庫中能與誘餌蛋白hPER1-PAS結構域相互作用的蛋白。并且采用營養(yǎng)缺陷培養(yǎng)基、β-半乳糖苷酶印膜法檢測報告基因的表達；免疫共沉淀實驗確證蛋白間的相互作用。陽性克隆子經(jīng)PCR擴增，進行測序和比對分析。 結果：成功構建以pGBKT7／hPer1<,PAS>為誘餌蛋白的表達質(zhì)粒；構建人腦cDNA文庫；成功構建pGBKT7／hPer1<,PAS>和pGADT7-Rec／cDNA的酵母雙雜交系統(tǒng)，并經(jīng)過營養(yǎng)缺陷篩選、β-半乳糖苷酶印膜

4、法檢測以及免疫共沉淀實驗，總共篩選到28個陽性克隆子。其中一個經(jīng)過測序和序列比對，證實為RACK1<,131-306>片段。 第二部分 RACK1與PER1相互作用關鍵WD40結構域的研究 方法：構建5種含RACK1不同WD結構域的重組質(zhì)粒：pGADT7-Rec/WD1-7；pGADT7-Rec/WD4-7；pGADT7-Rec/WD5-7；pGADT7-Rec/WD6-7；pGADT7-Rec/WDI-5，并鑒定。采

5、用共轉染法將構建成功的重組質(zhì)粒分別與誘餌質(zhì)粒pGBKT7/hPERl<,PAS>共轉染酵母AH109，轉化子依次在SD/-Leu/-Trp；SD/-His/-Leu/-Trp；SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp營養(yǎng)缺陷平板上鋪板生長。β-半乳糖苷酶印膜法檢測報告基因LacZ的表達。結果呈陽性的克隆子進一步采用免疫共沉淀實驗證實與PER1的相互作用。 結果：成功構建5種含RACK1不同WD結構域的靶質(zhì)粒。雜交后結果顯示，

6、RACK1全長WD1-7（1-317aa）、C-端WD4-7（138-317aa）以及WD5-7（180-317aa）雜交后能在SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp四缺營養(yǎng)缺陷培養(yǎng)基上生長，并能激活報告基因LacZ的表達。而N-端WD1-5（1-224aa）和C-端WD6-7（219-317aa）與PER1PAS結構域的雜交信號為陰性。表明RACK1的C端3個WD40結構域為兩種蛋白結合所必需的位點。免疫共沉淀實驗進一步證實，全

7、長WD1-7、WD4-7和WD5-7蛋白片段能與誘餌蛋白hPER1-PAS結合，結合的關鍵部位位于第5至7WD40結構域，即WD5-7才是RACK1與PER1相互作用的最小WD40結構域片段。 第三部分 RACK1與PER1功能聯(lián)系的研究 方法：半定量RT-PCR檢測RACK1在人胎兒各組織中的表達。免疫組化法檢測RACK1在NIH3T3細胞內(nèi)的表達。將pcDNA3.1-mPer1轉染NIH3T3細胞后，通過RT-PC

8、R檢測RACK1表達量的改變；同時通過免疫組化法檢測轉染細胞中RACK1分布的改變。四種hPER1干擾質(zhì)粒：pTER/hPER1-I（hper1：2155-2173）；pTER/hPER1-II（hper1：398-416）；pTER/hPER1-III（hper1：1653-1671）；pTER/hPER1-IV（hper1：3785-3803）分別轉染SH-YSY細胞后，檢測轉染效率。采用效率最高的干擾質(zhì)粒轉染SH-Y5Y細胞，檢測

9、其對RACK1表達的影響。 結果：RACK1廣泛分布在人心、腦、肝、肺、腎、脾、小腸、骨骼、肌肉組織中，在各種組織中均有較高的表達，尤其以心臟中的表達量最高，而腦中的表達量相對其它組織較低。在細胞中，RACK1主要在細胞漿內(nèi)高表達，在細胞核中有一定量的表達。轉染pcDNA3.1-mPer1的NIH3T3細胞中RACK1的表達未見明顯改變，說明RACK1的表達量不受PER1過表達的影響。但PER1的高表達伴隨RACK1的細胞分布改

10、變，即從散布胞漿到聚集于核周。四種hPer1干擾質(zhì)粒中，pTER/hPER1-II的干擾效率最高，達到了84.9％。將pTER/hPER1-II干擾質(zhì)粒轉染SH-Y5Y細胞后，能有效抑制hPer1的表達，但不能抑制Rack1的表達。 結論：RACK1是新的hPER1-PAS結構域相互作用蛋白，RACK1的WD5-7是與hPER1-PAS相互作用的最小結構域。RACK1與PER1存在一定的功能聯(lián)系，PER1過表達能引起細胞內(nèi)RAC