TGFβ-SMAD信號通路對豬顆粒細(xì)胞和繁殖性狀的作用研究.pdf

1、哺乳動物的卵泡早期發(fā)育包括始基卵泡的形成和隨后向初級卵泡、次級卵泡的轉(zhuǎn)化，TGFβ信號通路在這一過程中發(fā)揮著重要的作用。該信號通路的激活是由 TGFβ超家族的TGFβs配體分子與其受體結(jié)合，從而使受體磷酸化，磷酸化的受體再直接作用于 SMAD蛋白，SMAD蛋白將配體和受體的作用信號傳遞到細(xì)胞核內(nèi)，從而調(diào)控特定基因的表達(dá)。TGFβ1和 TGFβRⅠ作為 TGFβ信號通路的核心因子，在其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中起著重要的作用，參與調(diào)節(jié)卵泡發(fā)育、卵母細(xì)胞和

2、顆粒細(xì)胞以及顆粒細(xì)胞和卵泡腔細(xì)胞之間的雙向信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。OSP1啟動子是目前已知的能夠在卵巢組織中高效表達(dá)的啟動子，能夠為研究外源基因在豬卵巢顆粒細(xì)胞中的作用提供可行的調(diào)控元件。因此，本研究針對 TGFβ1和 TGFβRⅠ基因?qū)ωi卵泡發(fā)育的作用，設(shè)計以下實驗，具體研究內(nèi)容如下：
　?。?）采集梅山與杜洛克經(jīng)產(chǎn)母豬各3頭的卵泡樣品，經(jīng) qRT-PCR方法檢測 TGFβ/SMAD信號通路基因，THBS1、DCN、LTBP1、TGFβ1、T

3、GFβ2、TGFβ3、TGFβRⅠ、TGFβRⅡ、SMAD2、SMAD3、SMAD4、SKP1基因在梅山、杜洛克 S、M1、M2、L卵泡中的表達(dá)量變化。結(jié)果表明：TGFβ/SMAD信號通路基因均在梅山與杜洛克的 M2卵泡中存在表達(dá)差異，特別是 LTBP1、TGFβ1及 TGFβRⅠ基因在梅山豬各級卵泡中的表達(dá)量均極顯著高于杜洛克（P＜0.01），這提示 TGFβ/SMAD基因可能參與卵泡發(fā)育過程。
　?。?）根據(jù)已知大鼠 OSP-

4、1啟動子序列擴(kuò)增大鼠 OSP-1片段，將其定向克隆到 pcDNA3.1（+）中替代 CMV啟動子，并在其下游插入 ZsGREEN基因片段，構(gòu)建真核表達(dá)載體pOSP-1-ZsGREEN；重組質(zhì)粒在脂質(zhì)體 LipofectamineTM2000的介導(dǎo)下轉(zhuǎn)染不同細(xì)胞，在熒光顯微鏡下觀察 ZsGREEN表達(dá)情況，qRT-PCR方法檢測該啟動子在不同細(xì)胞中啟動ZsGREEN基因表達(dá)的活性。結(jié)果顯示：經(jīng)克隆測序，得到了465bp OSP-1啟動子序

5、列，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染卵巢顆粒細(xì)胞、Hela細(xì)胞可以觀察到綠色熒光；qRT-PCR分析 ZsGREEN基因在豬卵巢顆粒細(xì)胞、Hela細(xì)胞中高表達(dá)，在肌細(xì)胞中表達(dá)量極低，表明 OSP-1啟動子可驅(qū)動外源基因在豬卵巢顆粒細(xì)胞中高效表達(dá)，為構(gòu)建可用于豬卵巢顆粒細(xì)胞的表達(dá)載體提供了啟動子。
　?。?）根據(jù)GenBank中豬的TGFβRⅠ基因mRNA序列，針對基因編碼區(qū)設(shè)計5對shRNA干擾片段。以 pPLL3.7作為載體骨架，通過替換其中 CM

6、V啟動子，分別構(gòu)建了pCMV-TGFβRⅠ-shRNA及 pOSP1-TGFβRⅠ-shRNA干擾載體，通過脂質(zhì)體LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染豬卵巢顆粒細(xì)胞，分析 TGFβRⅠ基因的相對表達(dá)量，檢測pOSP1-TGFβRⅠ-sh5干擾載體及在細(xì)胞培養(yǎng)液中添加細(xì)胞生長因子 TGFβ1處理對豬卵巢顆粒細(xì)胞的細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡的影響。結(jié)果顯示：經(jīng)測序證實，5對合鏈的干擾片段和 OSP1啟動子插入位置符合預(yù)期，且上下游表達(dá)調(diào)控元件

7、完整，表明 pCMV-TGFβRⅠ-shRNA及pOSP1-TGFβRⅠ-shRNA干擾載體構(gòu)建成功；qRT-PCR分析 TGFβRⅠ基因在豬卵巢顆粒細(xì)胞中的表達(dá)量，含有 OSP1啟動子的干擾載體干擾效率高于 CMV啟動子干擾載體，差異顯著（P＜0.05）。5個 pOSP1-TGFβRⅠ-shRNA干擾載體的干擾效率依次為64％、56%、61%、62%、78%，其中 pOSP1-TGFβRⅠ-sh5對 TGFβRⅠ基因的沉默效果最好；流

8、式細(xì)胞儀檢測pOSP1-TGFβRⅠ-sh5干擾載體及添加細(xì)胞生長因子 TGFβ1處理對豬卵巢顆粒細(xì)胞增殖的影響，干擾載體組細(xì)胞增殖率下降，差異極顯著（P＜0.01），添加 TGFβ1細(xì)胞增殖率下降，差異顯著（P＜0.05）；對豬卵巢顆粒細(xì)胞凋亡的影響，干擾載體組及添加 TGFβ1細(xì)胞均會促進(jìn)細(xì)胞凋亡，差異極顯著（P＜0.01）。
　?。?）采用 PCR-SSCP技術(shù)檢測 TGFβRⅠ基因和 TGFβ1基因多態(tài)性，分析其與豬產(chǎn)活仔

9、數(shù)之間的關(guān)聯(lián)性。結(jié)果顯示，TGFβRⅠ基因第7內(nèi)含子第808位堿基存在 A→G突變，在大白豬群體中檢測出 AA、AG、GG三種基因型，GG型母豬產(chǎn)活仔數(shù)比 AA型多3.18個（P＜0.01），比 AG型多1.83個（P＜0.05），長白豬群體中檢測出 AA、AG兩種基因型，兩種基因型母豬產(chǎn)活仔數(shù)之間無顯著差異；TGFβ1基因在第7外顯子上游的第9位堿基存在C→T突變，在大白及長白豬群體中均檢測出 CC、TT兩種基因型，未檢測出 CT基因

10、型，兩種基因型母豬產(chǎn)活仔數(shù)之間無顯著差異，表明 TGFβRⅠ基因多態(tài)性與大白豬的產(chǎn)活仔數(shù)之間存在一定的關(guān)聯(lián)性。
　　本研究分析了 TGFβ/SMAD信號通路基因在梅山和杜洛克經(jīng)產(chǎn)母豬不同級別卵泡中的差異表達(dá)規(guī)律，TGFβRⅠ和 TGFβ1基因?qū)ωi卵巢顆粒細(xì)胞的調(diào)控作用，及這兩個基因多態(tài)性與豬產(chǎn)活仔數(shù)之間的關(guān)聯(lián)性，為明確 TGFβ/SMAD信號通路在卵泡發(fā)育過程中的作用，揭示 TGFβRⅠ和 TGFβ1基因?qū)ωi顆粒細(xì)胞生物學(xué)功能的影