沉默BMPR-IB基因?qū)ωi卵巢顆粒細(xì)胞凋亡及BMP通路相關(guān)基因表達(dá)的影響.pdf

1、BMPR-IB基因?qū)儆贐MP家族的Ⅰ型受體,存在于許多細(xì)胞類(lèi)型中,主要調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)和分化。在綿羊中,BMPR-IB基因中的堿基突變導(dǎo)致了氨基酸的改變,使得BMPR-IB基因部分失活,改變了BMP信號(hào)通路的傳遞機(jī)制,導(dǎo)致卵巢顆粒細(xì)胞對(duì)配體的抑制不再敏感,進(jìn)而提高了綿羊的排卵率和繁殖力。近來(lái)發(fā)現(xiàn),BMPR-IB基因的缺失,使小鼠卵巢顆粒細(xì)胞減少且聚集在一起,引起小鼠發(fā)情周期不規(guī)律和假孕反應(yīng)。
　　 本研究以豬卵巢顆粒細(xì)胞為試驗(yàn)材料,

2、利用流式細(xì)胞術(shù)、real time RT-PCR等方法檢測(cè)沉默BMPR-IB基因?qū)ωi卵巢顆粒細(xì)胞凋亡的影響；用RNAi技術(shù)阻抑BMPR-IB基因表達(dá),在此基礎(chǔ)上,添加FSH,利用流式細(xì)胞術(shù)、real time RT-PCR等方法檢測(cè)沉默BMPR-IB基因?qū)SH誘導(dǎo)的豬卵巢顆粒細(xì)胞的影響；用BMP配體(BMP6)激活BMP信號(hào)通路,用real time RT-PCR方法檢測(cè)通路中受體及Smads的表達(dá)量。
　　 1 BMPR-I

3、B—siRNA轉(zhuǎn)染豬卵巢顆粒細(xì)胞及其效率檢測(cè)
　　 根據(jù)豬BMPR-IB基因序列合成小分子RNA,利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染豬卵巢顆粒細(xì)胞以及流式細(xì)胞儀檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率,在BMPR-IB-siRNA轉(zhuǎn)染濃度為100nmoL時(shí),轉(zhuǎn)染效率為63.22％；利用熒光定量PCR檢測(cè)BMPR-IB mRNA表達(dá)水平,在作用36h時(shí),BMPR-IB-siRNA抑制效果最好,試驗(yàn)組較空白組下降65％。利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)干擾后顆粒細(xì)胞凋亡率。結(jié)果顯示,siRNA

4、試驗(yàn)組凋亡率(16.86％)顯著高于對(duì)照組(10.55％),且相應(yīng)地抗凋亡基因Bcl-2表達(dá)量顯著下降,表明沉默BMPR-IB可促進(jìn)豬卵巢顆粒細(xì)胞的凋亡。
　　 2沉默BMPR-IB對(duì)FSH誘導(dǎo)豬卵巢顆粒細(xì)胞凋亡的影響
　　 為了沉默BMPR-IB對(duì)FSH誘導(dǎo)豬卵巢顆粒細(xì)胞凋亡的影響,采用RNAi技術(shù)沉默BMPR-IB基因然后添加FSH。利用流式細(xì)胞儀以及real time RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞的凋亡率和凋亡基因的表達(dá)量

5、,以及類(lèi)固醇相關(guān)合成酶的表達(dá)量。結(jié)果表明:FSH能抑制細(xì)胞凋亡,沉默BMPR-IB基因后再添加FSH使細(xì)胞凋亡率減弱但是效果不明顯,與之對(duì)應(yīng)的原凋亡基因Bax和抗凋亡基因Bcl-2的變化不明顯；FSH能使FSHR的表達(dá)量增加,但是BMPR-IB表達(dá)的消減抑制了FSH增加自身受體的表達(dá)量；另外,發(fā)現(xiàn)添加FSH能使CYP19a1和CYP11a1的表達(dá)量增加,但BMPR-IB表達(dá)的消減抑制了FSH引起的CYP19a1和CYP11a1的表達(dá)的增

6、加。
　　 3沉默BMPR-IB對(duì)BMP6誘導(dǎo)的BMP信號(hào)通路中相關(guān)基因表達(dá)的影響
　　 為了研究BMPR-IB-siRNA轉(zhuǎn)染豬卵巢顆粒細(xì)胞對(duì)BMP信號(hào)通路的影響,采用RNAi技術(shù)沉默BMPR-IB基因,阻斷信號(hào)傳導(dǎo),另一方面,添加BMP6來(lái)激活通路,利用real time RT-PCR分別檢測(cè)阻抑或激活后受體和Smads的表達(dá)量。結(jié)果表明,沉默BMPR-IB能使受體BMPR-ⅠA和BMPR-Ⅱ的表達(dá)量增加,Smad1

7、、Smad5和Smad8基因的mRNA表達(dá)量下降,Smad7基因的mRNA表達(dá)量顯著增加。而添加配體BMP6使受體BMPRⅠA和BMPRⅡ的表達(dá)量下降,Smad1、Smad5和Smad8基因的mRNA表達(dá)量增加,Smad7基因的mRNA表達(dá)量下降。BMPR-IB—siRNA阻抑通路后用BMP6激活,與BMP6組相比,受體基因BMPRⅠA和BMPRⅡ以及Smad1和Smad5的表達(dá)都顯著變化,但Smad8的表達(dá)量明顯下降,而與抑制組相比,