β-catenin在豬卵巢組織中的表達(dá)以及對(duì)豬卵巢顆粒細(xì)胞凋亡及類固醇生成酶的影響.pdf

1、以β-catenin為關(guān)鍵信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子的Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在雌性發(fā)育過程中有重要作用,其表達(dá)缺失或者突變都會(huì)引起Wnt/β-catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)紊亂,從而對(duì)機(jī)體組織或細(xì)胞產(chǎn)生重要影響。敲除Wnt4可導(dǎo)致小鼠在出生前部分的性反轉(zhuǎn)以及卵母細(xì)胞的衰竭,在敲除β-catenin的小鼠顆粒細(xì)胞中形成內(nèi)含紊亂和多形性粒層細(xì)胞的卵泡樣結(jié)構(gòu),可導(dǎo)致顆粒細(xì)胞癌的發(fā)生。近來發(fā)現(xiàn),β-catenin參與了促性腺激素釋放激素調(diào)控的轉(zhuǎn)錄網(wǎng)絡(luò),對(duì)激素生成有重要作

2、用。
　　 本研究以二花臉、皮特蘭,商品雜種豬的卵巢以及豬卵巢顆粒細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)材料,利用real time RT-PCR檢測了不同豬種卵巢內(nèi)β-catenin以及不同生長時(shí)期卵泡與卵巢顆粒細(xì)胞、卵母細(xì)胞內(nèi)β-catenin的表達(dá)水平；利用RNAi方法敲減β-catenin,同時(shí)利用LiCl拮抗GSK-3β對(duì)β-catenin的磷酸化、降解作用,使胞質(zhì)內(nèi)β-catenin含量積聚的原理,用LiCl持續(xù)處理顆粒細(xì)胞使之過表達(dá)。利用流式

3、細(xì)胞術(shù)、real time RT-PCR、western blot等方法從沉默和過表達(dá)兩個(gè)方面研究β-catenin基因?qū)ωi卵巢顆粒細(xì)胞凋亡以及類固醇激素合成酶的影響。
　　 主要研究結(jié)果如下:
　　 1利用real time RT-PCR法檢測不同品種豬卵巢以及不同生長時(shí)期豬卵泡及卵巢顆粒細(xì)胞、卵母細(xì)胞內(nèi)Wnt/β-catenin信號(hào)通路關(guān)鍵信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子β-catenin的表達(dá)情況,結(jié)果表明:β-catenin在不同品

4、種豬卵巢中有差異表達(dá),二花臉豬卵巢內(nèi)的β-catenin表達(dá)量是普通商品豬卵巢的近3倍(p<0.05),而皮特蘭豬巢內(nèi)的β-catenin表達(dá)量只有普通商品豬卵巢的40％。β-catenin在卵泡的不同發(fā)育階段有差異表達(dá),大卵泡中β-catenin表達(dá)量顯著高于中卵泡和小卵泡(p<0.05)。β-catenin在卵巢顆粒細(xì)胞和卵母細(xì)胞中亦有差異表達(dá),顆粒細(xì)胞中β-catenin含量是卵母細(xì)胞中的近2.5倍(p<0.05)。
　　

5、 2為了研究Wnt/β-catenin信號(hào)通路在豬卵泡顆粒細(xì)胞中的作用,本研究從豬卵巢卵泡(3-5mm)內(nèi)分離顆粒細(xì)胞(pGCs)進(jìn)行體外培養(yǎng)?；讦?catenin在該通路中的核心地位,分別采用RNAi技術(shù)“沉默”豬β-catenin基因,阻抑Wnt/β-catenin信號(hào)通路,LiCl處理激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路以檢測β-catenin對(duì)豬卵泡顆粒細(xì)胞凋亡和類固醇激素合成的影響。結(jié)果表明:(1)采用的RNAi技術(shù)成功地

6、“敲減”豬β-catenin基因,在mRNA水平該基因被下調(diào)59.93％(p<0.05),蛋白水平被下調(diào)。建立了Wnt/β-catenin信號(hào)通路阻抑的細(xì)胞模型。敲減β-catenin顯著增加細(xì)胞凋亡率,上調(diào)Bax的表達(dá)(32.76％,p<0.05),下調(diào)BCL-2的表達(dá)(44.28％,p<0.05),并下調(diào)P450arommRNA的表達(dá)(47.72％,p<0.05),但不影響P450scc的表達(dá)。(2)LiCl處理成功激活Wnt/β-

7、catenin通路,β-catenin在mRNA水平該基因被上調(diào)95.15％(p<0.05),蛋白水平被上調(diào)。建立了Wnt/β-catenin信號(hào)通路激活的細(xì)胞模型。過表達(dá)β-catenin顯著增加細(xì)胞凋亡率下調(diào)Bax的表達(dá)(25.60％,p<0.05),上調(diào)BCL-2的表達(dá)(12.58％,p>0.05),并上調(diào)P450arom mRNA(151.6％,P<0.05)和P450scc mRNA(124.3％,p<0.05)的表達(dá)。表明W