蛻皮甾酮對人臍帶間充質(zhì)干細胞生物學(xué)特性的影響.pdf

1、背景：自從間充質(zhì)干細胞于1966年被Friedenstein從骨髓中發(fā)現(xiàn)開始,越來越多的研究發(fā)現(xiàn)間充質(zhì)干細胞在一定的條件下具有向內(nèi)、中、外三個胚層分化的能力,其中包括分化為骨細胞軟骨細胞、脂肪細胞、內(nèi)皮細胞、肝細胞、心肌細胞等多種細胞的潛能,可以廣泛參與組織器官損傷的修復(fù)過程,成為組織工程和干細胞治療領(lǐng)域的研究熱點。其中骨髓來源的間充質(zhì)干細胞(BMSCs)憑借易于培養(yǎng)擴增、遺傳背景相對穩(wěn)定且多向分化特性不受影響等特性,被廣泛用于細胞及組

2、織多種疾病的替代治療。但隨著對間充質(zhì)干細胞研究的不斷深入,發(fā)現(xiàn)成年動物骨髓源間充質(zhì)干細胞數(shù)量及增殖、分化潛能隨年齡的增大而不斷下降,且供者間充質(zhì)干細胞的采集須行骨髓穿刺術(shù),由于疾病的原因,病人常有感染、體質(zhì)較弱等因素也限制了自體骨髓間充質(zhì)干細胞移植的廣泛應(yīng)用。因此尋找新的間充質(zhì)干細胞來源是近年來國內(nèi)外干細胞研究的熱點之一。1991年,McElreavey等首次報道,從人臍帶的WJ組織中分離并培養(yǎng)到了一種成纖維樣細胞,具有較高的分化潛能。

3、隨后,數(shù)位研究者也分別報道從WJ中分離到豐富的MSCs。通過大量體外誘導(dǎo)實驗證實,特定條件下其同樣具有成骨、成軟骨、成脂肪、成肌肉、成血管內(nèi)皮、成神經(jīng)細胞等多向分化能力,通過和其他來源MSCs特別是和作為MSCs金標(biāo)準(zhǔn)的BMSCs相比,臍帶間充質(zhì)干細胞具有巨大優(yōu)勢:首先,來源廣泛,取材方便,供者無痛苦；其次,相對純凈,污染機會少；第三,含量豐富,較為原始,增殖分化能力強,免疫原性低,生物性能穩(wěn)定,可以為實驗和臨床提供充足的細胞來源。因此

4、,臍帶間充質(zhì)干細胞有望成為骨髓間充質(zhì)干細胞的理想替代來源,成為近來基礎(chǔ)研究與臨床廣泛研究的熱點?？蒲腥藛T和公眾均寄希望通過間充質(zhì)干細胞領(lǐng)域的研究治愈諸如難愈性創(chuàng)面,多臟器損傷,心肌梗死等傳統(tǒng)方式治療效果欠佳的疾病。盡管目前間充質(zhì)干細胞治療在臨床上的效果尚未得到完全確證,還是有越來越多的國家正加入此項研究。然而,間充質(zhì)干細胞治療要想真正從實驗室走向臨床應(yīng)用還面臨著諸多挑戰(zhàn),尚有很多關(guān)鍵性問題亟待解決。特別是間充質(zhì)干細胞體外的生物學(xué)特性研究

5、至關(guān)重要,是其臨床應(yīng)用的基礎(chǔ)及前提。
　　 蛻皮甾酮(EDS),是一種調(diào)控昆蟲蛻皮過程的激素,廣泛存在于眾多植物類群及動物類群中,結(jié)構(gòu)類似于雌二醇,實驗證實其能夠有效促進哺乳動物的多種組織和器官的核酸與蛋白質(zhì)的合成及糖和脂類代謝。由于該類物質(zhì)來源廣泛,生物學(xué)特性復(fù)雜,因此吸引了許多學(xué)者投身其研究工作。Otaka等報道羥基蛻皮甾酮無論體內(nèi)還是體外實驗均可迅速刺激大鼠肝臟蛋白的合成。體外實驗中,羥基蛻皮甾酮能夠通過促進合成,進而增強

6、微粒體和核糖體的蛋白合成能力。Yoshida T等報道了蛻皮甾酮對糖代謝的調(diào)節(jié)效應(yīng),預(yù)先腹腔注射羥基蛻皮甾酮能夠?qū)垢骨蛔⑸湟雀哐撬丶办o脈注射抗胰島素引起的高血糖癥。Syrov VN等報道蛻皮甾醇具有保護肝臟的作用。隨著研究的不斷深入,蛻皮甾酮更多的生物學(xué)特性將被揭示出來。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)EDS具有促進人臍靜脈內(nèi)皮細胞增殖,促進創(chuàng)傷皮膚愈合,促進表皮及骨髓間充質(zhì)干細胞增殖等作用。最新研究表明,特定條件下甾體類激素地塞米松具有誘導(dǎo)h

7、UCMSCs分化為骨細胞并表達骨橋蛋白、涎蛋白、骨連接素等骨性標(biāo)志物的能力,且可在黏多糖的基質(zhì)上形成類似于關(guān)節(jié)軟骨的球狀骨針,可有效誘導(dǎo)間充質(zhì)干細胞的成骨分化,同屬甾體類物質(zhì)的蛻皮甾酮表現(xiàn)出的生物多效性,提示其對促臍帶間充質(zhì)干細胞增殖及誘導(dǎo)分化等方面有一定的影響,最新研究顯示間充質(zhì)干細胞經(jīng)誘導(dǎo)劑作用后可有效治療骨質(zhì)疏松等疾病,EDS能否誘導(dǎo)臍帶間充質(zhì)干細胞成骨分化尚不明確,進行此項研究具有廣闊的應(yīng)用前景。
　　 目的：分離培養(yǎng)并

8、鑒定人臍帶間充質(zhì)干細胞(human umbilical cord mesenchymalstem cells,hUCMSCs),為后續(xù)實驗提供充足的種子細胞。
　　 方法：采用酶消化法及組織塊培養(yǎng)法分離出hUCMSCs,通過培養(yǎng)、傳代擴增,從而獲取相對均一、足夠數(shù)量的臍帶間充質(zhì)干細胞。取第3代hUCMSCs通過細胞流式學(xué)檢測對臍帶間充質(zhì)干細胞表面特異性標(biāo)志CD29、CD34、CD44、CD45、CD90、CD105及多向分化能力

9、加以鑒定。取第3、7代hUCMSCs繪制細胞生長曲線,并觀察細胞形態(tài)學(xué)變化。
　　 結(jié)果：
　　 1.hUCMSCs的形態(tài)學(xué)觀察:倒置顯微鏡下觀察,酶消化法所得細胞,原代接種24 h可見有少量細胞貼壁,外觀呈紡錘形和短棒形,并可見細胞核。培養(yǎng)至5d左右細胞大部為雙突起的長梭形、扁平形生長,核仁較前明顯。培養(yǎng)至10d左右,細胞形態(tài)變?yōu)闉榈湫偷某衫w維細胞形態(tài),當(dāng)細胞達到80％融合時予以消化、傳代。傳代培養(yǎng)至P3后可出現(xiàn)明顯的

10、單一細胞集落。從原代培養(yǎng)來看,膠原酶消化法比組織塊培養(yǎng)法的效率更高,大約10d就可以進行傳代,而組織塊培養(yǎng)法要14d才能傳代,形態(tài)學(xué)變化及之后的傳代兩者之間沒有顯著性差別。
　　 2.流式細胞學(xué)檢測:CD34陽性率為7.54％,CD45陽性率為5.35％,CD29陽性率為98.45％,CD44陽性率為97.83％,CD90陽性率為97.36％,CD105陽性率為99.20％.
　　 3.hUCMSCs體外多向誘導(dǎo)分化:<

11、br>　　 3.1 hUCMSCs成骨誘導(dǎo)的形態(tài)變化及功能鑒定:成骨誘導(dǎo)5d左右,細胞形態(tài)逐漸由長梭形變?yōu)槿切位蚨嘟切蔚?。高倍顯微鏡下觀察可見細胞質(zhì)內(nèi)含顆粒樣物質(zhì)。誘導(dǎo)10d,細胞胞質(zhì)中及胞質(zhì)外均可見較多細小黑色顆粒,胞核顏色較淡,胞質(zhì)色變深。3W時細胞生長密集,中央可見類似結(jié)節(jié)狀的結(jié)構(gòu),部分細胞呈現(xiàn)層疊樣生長。堿性磷酸酶及茜素紅染色顯示強陽性,符合成骨細胞的特征。說明hUCMSCs在體外具有向成骨細胞分化的潛能。
　　 3

12、.2 hUCMSCs成脂誘導(dǎo)的形態(tài)變化及功能鑒定:成脂誘導(dǎo)7d左右,細胞形態(tài)逐漸由長梭形變?yōu)槎讨?；在誘導(dǎo)約14d時細胞變?yōu)闄E圓形、圓形；20d時胞質(zhì)內(nèi)可見脂滴形成,油紅“O”染色呈強陽性。表明hUCMSCs在體外具有向脂肪細胞分化的潛能。
　　 4.hUCMSCs生長曲線:hUCMSCs生長曲線呈“S”形,接種后第1～2天為潛伏適應(yīng)期,從第3天起細胞開始增殖并進入對數(shù)生長期,第5天達到高峰,7天以后進入平臺期。根據(jù)生長曲線可知

13、hUCMSCs的群體倍增時間約為24h。增殖曲線顯示本實驗中P3、P7代細胞增殖速率無顯著差異。
　　 結(jié)論：
　　 1.hUCMSCs可通過酶消化法及組織塊培養(yǎng)法體外分離、純化培養(yǎng),細胞生長穩(wěn)定,可連續(xù)傳代。組織塊培養(yǎng)法的原代培養(yǎng)時間為14～16 d,培養(yǎng)時間較長,而采用膠原酶消化法可快速獲得大量貼壁生長的MSCs,且操作簡便易行,可更好地保持細胞活力,大大縮短了原代培養(yǎng)時間。
　　 2.經(jīng)流式紐胞儀檢測,hU

14、CMSCs均一地高表達間質(zhì)細胞標(biāo)志CD29、CD44、CD90、CD105,陰性表達造血系標(biāo)志CD34、CD45,本實驗結(jié)果表明,hUCMSCs與其他組織來源的MSCs流式檢測表型一致。
　　 3.經(jīng)成骨和成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)后,通過ALP染色以及茜素紅染色證實分化為成骨細胞,通過油紅“O”染色證實分化為脂肪細胞,實驗證實分離所得hUCMSCs具有多向分化能力。
　　 4.hUCMSCs隨著傳代次數(shù)增加增殖能力未見顯著降低

15、。
　　 目的：觀察凍存復(fù)蘇后人臍帶間充質(zhì)干細胞(human umbilical cord mesenchymalstem cells,hUCMSCs)的復(fù)蘇率及增值活性,探討液氮長期保存間充質(zhì)細胞的可行性。
　　 方法：參照前面方法體外分離培養(yǎng)獲得原代人臍帶間充質(zhì)干細胞,采用改良分階段凍存方法,5個月后復(fù)蘇細胞培養(yǎng),觀察比較各實驗組細胞成活率和MTT法檢測細胞增值能力的差異,流式細胞儀檢測凍存細胞的表型變化。
　

16、　 結(jié)果：
　　 1.復(fù)蘇hUCMSCs的形態(tài)學(xué)特征。復(fù)蘇后細胞2h即開始貼壁,逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)樗笮渭岸嘟切?。?fù)蘇細胞一周左右即可傳代,傳至第3代時,細胞形態(tài)與正常培養(yǎng)對照組無明顯差別。
　　 2.流式細胞檢測復(fù)蘇hUCMSCs符合間充質(zhì)干細胞的表型特征。MTT法檢測顯示低溫凍存并沒有降低間充質(zhì)干細胞增殖活性。
　　 結(jié)論：通過檢測凍存復(fù)蘇細胞的存活率,臍帶間充質(zhì)干細胞表面標(biāo)志未發(fā)生改變,表明液氮凍存法可長期保存間充

17、質(zhì)干細胞；另外,恰當(dāng)選擇對數(shù)生長期的細胞凍存,且凍存細胞濃度應(yīng)達到1×106/ml,對于保證凍存成功同樣起著關(guān)鍵作用。
　　 目的：觀察蛻皮甾酮(Ecdysterone,EDS)對人臍帶間充質(zhì)干細胞(human umbilicalcord mesenchymal stem cells,hUCMSCs)體外增殖的影響,并探討其促進細胞增殖的可能機制。
　　 方法：取第3代hUCMSCs分別在基礎(chǔ)培養(yǎng)基(低糖DMEM培養(yǎng)基、

18、10％的胎牛血清、100U/m青/鏈霉素、4mmol/L L-谷氨酰胺)中加入不同濃度(0、25、50、100、150、200μg/ml)EDS予以干預(yù),分別于第1、3、5、7天行MTT法檢測細胞增殖活性；另外,設(shè)置相同分組EDS干預(yù)培養(yǎng)hUCMSCs7天,繪制細胞生長曲線,觀察比較細胞增殖差異。經(jīng)細胞流式儀測定不同分組細胞周期,觀察增殖期細胞所占比例。對數(shù)據(jù)行統(tǒng)計學(xué)處理。
　　 結(jié)果：
　　 1、MTT法檢測結(jié)果顯示經(jīng)

19、EDS干預(yù)培養(yǎng)的hUCMSCs增殖能力較空白對照組有顯著差異(P＜0.05),其中EDS100μg/ml、150μg/ml及200μg/ml三組細胞活性比較無顯著差異(P＞0.05),較其他實驗組有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 2、細胞生長曲線同樣顯示EDS實驗組可有效促進間充質(zhì)干細胞的增殖。其中EDS100μg/ml實驗組促增殖效果最明顯,EDS100μg/ml、150μg/ml及200μg/ml三組未見顯著性差異。

20、r>　　 3、流式細胞儀測定各組細胞周期顯示:EDS100μg/ml、150μg/ml及200μg/ml三組細胞S期細胞所占比例最大,與其他實驗組比較有顯著差異,同時三組細胞的增殖指數(shù)也顯著高于對照組。
　　 結(jié)論：本實驗證實體外條件下,EDS在一定濃度范圍內(nèi)具有促進hUCMSCs增殖的作用,該作用具有一定的濃度依賴性,當(dāng)EDS濃度為100μg/ml促增殖作用達到最佳效果,初步機制認為EDS主要是通過改變細胞周期促進細胞增殖。

21、
　　 目的：觀察蛻皮甾酮(Ecdysterone,EDS)對人臍帶間充質(zhì)干細胞(human umbilicalcord mesenchymal stem cells,hUCMSCs)成骨分化的影響。
　　 方法：人臍帶間充質(zhì)干細胞的分離、培養(yǎng)鑒定,取第5代臍帶間充質(zhì)干細胞分別在基礎(chǔ)誘導(dǎo)培養(yǎng)基中加入不同濃度EDS和地塞米松予以干預(yù),分別于第1、3、5、7天MTT法檢測細胞增殖率；另外,設(shè)置相同的分組誘導(dǎo)培養(yǎng)4周后,行茜素

22、紅及堿性磷酸酶鈣鈷法染色鑒定細胞成骨分化能力,計算陽性細胞百分比。
　　 結(jié)果：
　　 1.MTT檢測顯示一定范圍內(nèi)EDS在基礎(chǔ)誘導(dǎo)培養(yǎng)基中具有促進細胞增殖的作用,濃度增高至200μg/ml對細胞表現(xiàn)抑制作用,地塞米松對細胞增殖有抑制作用。
　　 2.茜素紅及堿性磷酸酶鈣鈷法染色鑒定顯示基礎(chǔ)誘導(dǎo)培養(yǎng)組細胞染色陰性,EDS及地塞米松組實驗組均可以誘導(dǎo)hUCMSCs鈣化結(jié)節(jié)形成,比較發(fā)現(xiàn)EDS200μg/ml組細胞陽