人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞生物學(xué)特性及體內(nèi)移植促進(jìn)皮膚創(chuàng)面修復(fù)的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:本研究旨在建立一種分離、培養(yǎng)擴(kuò)增臍帶源間充質(zhì)干細(xì)胞(humanumbilical cord derived mesenchymal stem cells，hUC-MSCs)的方法，通過對(duì)其基本生物學(xué)特性、體外誘導(dǎo)分化能力、綠色熒光蛋白(green fluorescentprotein GFP)基因質(zhì)粒對(duì)其標(biāo)記示蹤的可能性及體內(nèi)移植促進(jìn)皮膚創(chuàng)面修復(fù)的可行性等的研究，以期為組織工程種子細(xì)胞提供新的細(xì)胞來源，為燒傷、腫瘤等導(dǎo)致的皮膚缺損

2、患者的臨床治療提供新思路。 方法:1、首先建立hUC-MSCs分離和培養(yǎng)擴(kuò)增的方法并通過細(xì)胞形態(tài)學(xué)、細(xì)胞增殖的研究、細(xì)胞免疫表型分析及體外誘導(dǎo)分化能力的檢測對(duì)其基本生物學(xué)特性進(jìn)行研究并與生物學(xué)特性研究較多的臍血間充質(zhì)干細(xì)胞(humanumbilicalcord blood hUCB-MSCs)進(jìn)行比較(骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞Bone marrowmescnchymal stem cells BM-MSCs的生物學(xué)特性研究最多，但本實(shí)驗(yàn)

3、由于骨髓標(biāo)本來源受限)。2、將已轉(zhuǎn)化的GFP—N2大腸桿菌109菌種，進(jìn)行質(zhì)粒提取，脂質(zhì)體(lipofectamine 2000)介導(dǎo)轉(zhuǎn)染hUC-MSCs，分別于轉(zhuǎn)染24h，96h后計(jì)算熒光的轉(zhuǎn)染效率，以未標(biāo)記的同期細(xì)胞作為對(duì)照。3、將已標(biāo)記綠色熒光蛋白基因質(zhì)粒的hUC-MSCs移植至表皮缺損的裸鼠表皮缺損處，采用組織切片、免疫熒光等方法檢測裸鼠表皮愈合及hUC-MSCs在皮膚缺損處的分布。 結(jié)果:1、hUC-MSCs接種后24

4、—48h貼壁，成纖維細(xì)胞樣克隆形成(Unit-fibroblast like colony-forming，CFU-F)時(shí)間為5—7d，首次傳代時(shí)間為12—16d，對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞倍增時(shí)間為29h，均較hUCB-MSCs短。免疫表型分析顯示hUC-MSCs和hUCB-MSCs均表達(dá)粘附分子和基質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記CD13、CD29、CD105、CD166，不表達(dá)造血細(xì)胞標(biāo)記CD14、CD34、CD45，不表達(dá)內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記CD31，兩者表型基本一致，

5、無明顯區(qū)別。此外，實(shí)驗(yàn)還證實(shí)hUC-MSCs具有向成骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化能力。2、綠色熒光蛋白基因質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的hUC-MSCs 24h后綠色熒光表達(dá)率為37％，而且短期內(nèi)隨著培養(yǎng)時(shí)間延長，表達(dá)率有上升趨勢。3、實(shí)驗(yàn)組裸鼠大體觀察表皮愈合較對(duì)照組好，組織切片見實(shí)驗(yàn)組皮膚結(jié)構(gòu)層次較清晰而對(duì)照組大多數(shù)為疤痕愈合，結(jié)構(gòu)層次不清楚，免疫熒光觀察見hUC-MSCs在表皮缺損愈合的新生血管中有存活，對(duì)照組為陰性。 結(jié)論:1、成功建立了從人足

6、月臍帶中分離培養(yǎng)擴(kuò)增hUC-MSCs的方法，操作簡單、易行，分離培養(yǎng)的hUC-MSCs具有MSCs的基本生物學(xué)特性和免疫表型，且比hUCB-MSCs含量更豐富，具有更強(qiáng)的增殖能力，可以作為組織工程新的細(xì)胞來源。 2、脂質(zhì)體介導(dǎo)的綠色熒光蛋白基因質(zhì)粒轉(zhuǎn)染hUC-MSCs標(biāo)記示蹤技術(shù)是一種理想的較穩(wěn)定示蹤標(biāo)記技術(shù)，可以應(yīng)用為組織工程種子細(xì)胞示蹤的實(shí)驗(yàn)研究。 3、hUC-MSCs機(jī)體內(nèi)移植能促進(jìn)皮膚缺損的愈合，可為皮膚缺損患者的臨床治