胎盤羊膜和絨毛膜間充質(zhì)干細(xì)胞生物學(xué)特性及羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞移植修復(fù)大鼠局灶性腦缺血的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal Stem Cells，MSCs)是一種具有自我更新和多向分化能力的干細(xì)胞，有著潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值。以往研究主要集中在人骨髓來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞，但由于人骨髓來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞的獲得需要通過(guò)骨髓穿刺，而且其數(shù)量隨年齡的增長(zhǎng)而急劇下降，限制了人骨髓源間充質(zhì)干細(xì)胞的應(yīng)用。近年來(lái)有實(shí)驗(yàn)表明，MSCs還可從臍血、胎盤、羊水、臍靜脈內(nèi)皮下層、外周血及肌肉等組織中分離得到。其中，胎盤組織最受關(guān)注，它除了在胎兒發(fā)育、

2、營(yíng)養(yǎng)支持和維持耐受中發(fā)揮重要作用外，含有豐富的成體干細(xì)胞，成為尋找人類成體干/祖細(xì)胞的新組織來(lái)源。胎盤來(lái)源MSCs的表型、分化潛能與骨髓MSCs相似，且胎盤作為孕婦分娩后的廢棄物，易于獲得且對(duì)其研究和應(yīng)用無(wú)倫理道德的爭(zhēng)論，目前已成為間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源的新的研究熱點(diǎn)。
　　 胎盤羊膜中胚層(Amniotic Mesoderm)和絨毛膜中胚層（Chorionic Mesoderm）分別是體外分離獲得羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞(Amniotic

3、Mesenchymal stem cells，AMSCs)和絨毛膜間充質(zhì)干細(xì)胞(Chorionic Mesenchymal stem cells，CMSCs)的組織來(lái)源，兩者均由胚胎發(fā)育過(guò)程中的胚外中胚層(Extroembryonic Mesoderm)發(fā)育而來(lái)，但是隨著胚外中胚層被分割并與不同的胚胎組織發(fā)生相互作用，分布于不同位置的胚外中胚層組織發(fā)生了不同的變化，這些變化是否會(huì)導(dǎo)致體外分離培養(yǎng)獲得的MSC具有不同的生物學(xué)特性，進(jìn)一步深

4、入研究不同來(lái)源MSCs生物學(xué)特性，將為不同疾病模型的修復(fù)提供更有針對(duì)性的種子細(xì)胞。
　　 本研究旨在建立了有效的AMSCs和CMSCs體外擴(kuò)增體系，比較兩群MSCs的生物學(xué)特性，并在此基礎(chǔ)上，將AMSCs通過(guò)立體定向技術(shù)注入大鼠局灶性腦缺血MCAO模型（大腦中動(dòng)脈閉塞腦出血模型，middle cerebral artery occlusion model，MCAO模型）腦內(nèi)，觀察植入細(xì)胞的存活、遷移、分化及大鼠神經(jīng)功能恢復(fù)，初步

5、探討AMSCs移植治療局灶性腦缺血的作用和可能機(jī)制。
　　 第一部分AMSCs和CMSCs組織分布及體外擴(kuò)增體系的建立。
　　 目的:分析AMSCs、CMSCs在人胎盤組織中的分布特性、并建立相應(yīng)的體外擴(kuò)增體系。
　　 方法:取健康產(chǎn)婦正常剖宮產(chǎn)之足月胎兒的新鮮胎盤組織，鈍性分離羊膜層與絨毛膜層，采用不同方法對(duì)羊膜、絨毛膜組織進(jìn)行消化及體外培養(yǎng)，倒置顯微鏡觀察體外培養(yǎng)AMSCs、CMSCs的細(xì)胞形態(tài);流式細(xì)胞儀分

6、別檢測(cè)其表面標(biāo)志;采用多種誘導(dǎo)條件分別將兩群MSC細(xì)胞向脂肪細(xì)胞、軟骨細(xì)胞及骨細(xì)胞方向誘導(dǎo)，并用特異性染色法對(duì)誘導(dǎo)后細(xì)胞進(jìn)行鑒定。比較多種因子不同濃度下對(duì)CMSCs體外擴(kuò)增效果，選取75ng/mlFL進(jìn)一步比較其對(duì)兩群MSC細(xì)胞的擴(kuò)增效果，流式細(xì)胞儀檢測(cè)優(yōu)化培養(yǎng)條件下培養(yǎng)的兩群MSC的細(xì)胞表型;細(xì)胞計(jì)數(shù)分析FL對(duì)兩群MSCs的促增殖作用;RT-PCR分析兩群MSC中FL受體flt3基因表達(dá);分別將FL作用下的兩群MSC細(xì)胞向脂肪細(xì)胞、軟

7、骨細(xì)胞及骨細(xì)胞方向誘導(dǎo)，RT-PCR分析脂肪細(xì)胞、軟骨細(xì)胞和骨細(xì)胞特異性基因在誘導(dǎo)后兩群MSC細(xì)胞中的表達(dá)情況。
　　 結(jié)果:(1)免疫熒光染色顯示:羊膜組織中CD90和CD166陽(yáng)性細(xì)胞主要分布于羊膜上皮和羊膜間質(zhì)中，而絨毛膜組織中CD90和CD166陽(yáng)性細(xì)胞主要分布血管內(nèi)皮下、血管附近間質(zhì)內(nèi);免疫組織切片染色結(jié)果顯示:羊膜上皮、絨毛膜板間質(zhì)內(nèi)以及絨毛中軸血管周圍間質(zhì)內(nèi)可見CD105陽(yáng)性染色的細(xì)胞;(2)倒置顯微鏡觀察AMSC

8、s、CMSCs均呈典型的成纖維細(xì)胞樣貼壁生長(zhǎng)，流式細(xì)胞儀分析顯示，兩群MSC均高表達(dá)CD73、CD90和CD105，不表達(dá)CD14、CD34、CD45和HLA-DR;(3)體外擴(kuò)增培養(yǎng)的AMSCs、CMSCs成骨誘導(dǎo)后，細(xì)胞均由長(zhǎng)梭形向立方形轉(zhuǎn)變，Von Kossa染色可見細(xì)胞呈集落生長(zhǎng)并出現(xiàn)鈣結(jié)節(jié);成軟骨誘導(dǎo)2周后，AMSCs、CMSCs形態(tài)逐漸變得扁平，anti-collagen typeⅡ免疫組織化學(xué)染色可見陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)Ⅱ型膠原;

9、成脂肪誘導(dǎo)2周，培養(yǎng)的兩群MSC細(xì)胞內(nèi)均有明顯的脂滴出現(xiàn)，油紅O染色陽(yáng)性;(4)細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果表明，含F(xiàn)L的培養(yǎng)基能有效地促進(jìn)兩群細(xì)胞的體外增殖，且FL對(duì)CMSCs的促增殖作用更強(qiáng);(5)流式細(xì)胞儀分析顯示，含F(xiàn)L的培養(yǎng)基培養(yǎng)的兩群MSC仍高表達(dá)CD73、CD90、CD105，不表達(dá)CD14、CD34、CD45和HLA-DR;(6) RT-PCR結(jié)果顯示，AMSCs、CMSCs均表達(dá)flt3的mRNA;添加FL培養(yǎng)的兩群MSCs向脂肪細(xì)胞

10、、軟骨細(xì)胞和骨細(xì)胞誘導(dǎo)后，表達(dá)PLIN（脂肪細(xì)胞）、ACAN（軟骨細(xì)胞）和RUNX2（骨細(xì)胞）特異性基因。
　　 結(jié)論:從人胎盤羊膜、絨毛膜組織經(jīng)過(guò)特定的分離消化后，能有效地獲得AMSCs和CMSCs兩群MSCs細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)及誘導(dǎo)分化結(jié)果提示獲得的兩群MSCs均具有MSCs干細(xì)胞標(biāo)志及誘導(dǎo)分化能力，可以成為體外優(yōu)化培養(yǎng)的種子細(xì)胞;FL具有較強(qiáng)的促AMSCs、CMSCs體外增殖作用而對(duì)CMSCs的促增殖作用更為明顯，同時(shí)其能保

11、持兩群MSCs的細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞表型及多向分化潛能，因此FL可以作為體外培養(yǎng)、擴(kuò)增CMSCs的良好生長(zhǎng)因子。
　　 第二部分AMSCs和CMSCs生物學(xué)特性的比較。
　　 目的:分析AMSCs、CMSCs的生物學(xué)特點(diǎn)，比較其向神經(jīng)細(xì)胞分化和成血管潛能的差異。
　　 方法:取培養(yǎng)2代以后的AMSCs、CMSCs細(xì)胞，采用3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(1-Methyl-3-isobutylxanthine，IBMX)，對(duì)

12、兩群MSC細(xì)胞進(jìn)行神經(jīng)細(xì)胞方向誘導(dǎo)，繼而采用PT-PCR方法對(duì)分化細(xì)胞誘導(dǎo)前及誘導(dǎo)后不同時(shí)間神經(jīng)特異性蛋白表達(dá)情況進(jìn)行比較分析，免疫細(xì)胞化學(xué)方法對(duì)分化的細(xì)胞進(jìn)行鑒定;取培養(yǎng)2代以后的AMSCs和CMSCs細(xì)胞，將血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)誘導(dǎo)7天的兩群MSCs接種于Matrigel膠上，利用基質(zhì)膠上毛細(xì)血管樣結(jié)構(gòu)的形成實(shí)驗(yàn)比較兩群誘導(dǎo)細(xì)胞的體外成血管能力。
　

13、　 結(jié)果:(1) RT-PCR結(jié)果顯示，誘導(dǎo)前AMSCs表達(dá)nestin、mushashi-1、β-tubulinⅢ(Tujl)以及GFAP，而CMSCs僅有nestin的表達(dá);誘導(dǎo)兩天后，AMSCs除了仍舊有nestin、mushashi-1、β-tubulinⅢ(Tuj1)、GFAP的表達(dá)以外，還有NF表達(dá)，但CMSCs仍舊只有nestin的表達(dá);誘導(dǎo)五天后，AMSCs對(duì)各蛋白表達(dá)情況與誘導(dǎo)兩天的結(jié)果相似，只是nestin的表達(dá)量

14、有所下降，而CMSCs中除nestin以外，還有NF和GFAP表達(dá)，以上結(jié)果均說(shuō)明AMSCs較CMSCs具有更好的神經(jīng)生物學(xué)特性，更易于向神經(jīng)元或神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞分化;(2)基質(zhì)膠上毛細(xì)血管樣結(jié)構(gòu)的形成實(shí)驗(yàn)顯示，兩群MSC細(xì)胞均能在基質(zhì)膠上形成毛細(xì)血管樣結(jié)構(gòu)，但AMSCs較CMSCs形成毛細(xì)血管樣結(jié)構(gòu)慢;在毛細(xì)血管樣結(jié)構(gòu)的數(shù)目上，兩種細(xì)胞間也有明顯的差異，CMSCs形成的毛細(xì)血管樣結(jié)構(gòu)數(shù)明顯多于AMSCs。
　　 結(jié)論:在胎盤發(fā)育過(guò)

15、程中，由于兩群MSC細(xì)胞所接受的胚胎誘導(dǎo)不同，導(dǎo)致其表現(xiàn)出不完全相同的生物學(xué)特性，其中AMSCs表現(xiàn)出更強(qiáng)的神經(jīng)前體樣細(xì)胞的生物學(xué)特性而CMSCs具有較強(qiáng)的體外成血管能力。
　　 第三部分AMSCs移植對(duì)于局灶性腦缺血的修復(fù)作用及可能機(jī)制。
　　 目的:運(yùn)用AMSCs移植治療局灶性腦缺血，觀察移植后實(shí)驗(yàn)動(dòng)物神經(jīng)功能的恢復(fù)情況，分析其可能的修復(fù)作用及相關(guān)機(jī)制。
　　 方法:采用線栓法制備大鼠局灶性腦缺血模型，將腦缺

16、血大鼠隨機(jī)分為空白組和實(shí)驗(yàn)組，分別將PBS、BrdU標(biāo)記的AMSCs通過(guò)立體定向植入大鼠紋狀體內(nèi)。分別于不同時(shí)間采用神經(jīng)損傷嚴(yán)重缺損評(píng)分(Neurological Severity Scores，NSS)，平衡木試驗(yàn)(Beam Balance Test，BBT)，以及抬高身體搖擺試驗(yàn)(Elevated BodySwing Test，EBST)對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的神經(jīng)功能進(jìn)行評(píng)分，8周后處死大鼠取腦組織，行HE染色、BrdU免疫組化染色，觀察植入

17、AMSCs的存活、遷移情況。
　　 結(jié)果:應(yīng)用線栓法短暫閉塞大鼠右側(cè)大腦中動(dòng)脈后，大鼠出現(xiàn)左側(cè)肢體不同程度偏癱同時(shí)伴有右側(cè)Homer氏征。神經(jīng)功能行為學(xué)檢測(cè)顯示:AMSCs移植大鼠NSS、BBT、EBST在細(xì)胞移植后1、3、6、8周與PBS對(duì)照組比較有顯著好轉(zhuǎn)(P＜0.01)，8周后，AMSCs組可見較多BrdU表達(dá)陽(yáng)性的細(xì)胞，細(xì)胞集中在移植位點(diǎn)及周圍區(qū)域，有向缺血灶遷移的趨勢(shì)，局部無(wú)膠質(zhì)增生和淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)。
　　 結(jié)論

18、:AMSCs腦內(nèi)移植能有效改善局灶性腦缺血大鼠的神經(jīng)功能癥狀，是治療局灶性腦缺血的一種可能措施。
　　 綜上所述，本課題建立了AMSCs和CMSCs有效的體外擴(kuò)增體系，結(jié)合胚胎發(fā)育過(guò)程中，羊膜、絨毛膜各自的發(fā)育特點(diǎn)，比較兩群MSCs向神經(jīng)細(xì)胞分化及體外成血管的生物學(xué)特性的差異，并在此基礎(chǔ)上，通過(guò)體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)具有良好神經(jīng)生物學(xué)特性的AMSCs在大鼠局灶性腦缺血MCAO模型的修復(fù)中效果顯著，為進(jìn)一步探討AMSCs移植治療局灶性腦