小分子大豆多肽的制備和分離純化研究.pdf

1、大豆中蛋白質(zhì)含量高，氨基酸組成合理，大豆多肽是大豆蛋白經(jīng)酶解后產(chǎn)生的分子量較低的化合物。研究表明：其氨基酸組成與大豆蛋白基本相同，且在整個(gè)pH范圍內(nèi)均有良好的溶解性及低粘度，比大豆蛋白具有更好的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和生物功能，如抗氧化、降血壓、降膽固醇、抗疲勞等。這些特性使得大豆多肽在食品、醫(yī)藥、化妝品等領(lǐng)域得到廣泛的開發(fā)和利用。 本文主要研究大豆分離蛋白水解過程中，在微波加熱、保持體系的pH、溫度不變條件下，用堿性蛋白酶和中性蛋白酶、胰蛋

2、白酶三酶水解大豆分離蛋白制備小分子大豆肽。以大豆分離蛋白水解氨基氮為評(píng)價(jià)指標(biāo)，用熒光分析等方法，系統(tǒng)研究了水解工藝過程，并詳細(xì)介紹了主要的工藝步驟。重點(diǎn)討論了影響酶水解的各種因素如酶用量，pH值，底物濃度，反應(yīng)溫度，微波作用時(shí)間等。首先用單酶水解大豆分離蛋白，確定最佳條件，然后確定雙酶、三酶分步協(xié)同水解的順序和制備小分子大豆多肽的最佳條件，以及大豆多肽的理化性質(zhì)與毛細(xì)管電泳法、凝膠排阻色譜法、反相高效液相色譜法分離純化條件，并通過毛細(xì)管

3、電泳方法、凝膠排阻色譜法對(duì)水解多肽的分子量分布范圍進(jìn)行測(cè)定。實(shí)驗(yàn)表明：三酶水解優(yōu)于單酶和雙酶，制得的大豆肽分子量主要集中在200-1100 D之間。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下： 1.小分子大豆肽的制備 ①大豆分離蛋白溶液在85℃水浴加熱預(yù)處理15min， ②單酶水解最佳條件： 胰蛋白酶水解大豆分離蛋白的最佳條件：水解最適pH值為8.0，溫度50℃，底物濃度5％，酶用量E/S為10％，微波水解時(shí)間15 min，氨基氮含量

4、可達(dá)6.40 mg/g： 堿性蛋白酶水解大豆分離蛋白的最佳條件是：水解最適pH值為8.5，溫度55℃，酶用量E/S為7％，底物濃度5％，微波加熱水解15 min，此時(shí)AN為62.10mmol/L中性蛋白酶水解大豆蛋白最佳條件為：水解最適pH7.0，溫度50℃，酶用量E/S為11％，底物濃度為5％，微波水解18min，此條件下水解AN含量最高為39.89 mmol/L。 ③三酶分步協(xié)同水解的最佳條件： 將底物濃度為

5、5％的料液，經(jīng)預(yù)處理后，先加堿性蛋白酶，在pH8.5，E/S為7％，溫度55℃條件下微波加熱水解10min；之后調(diào)整參數(shù)pH8，溫度52℃加入中性蛋白酶E/S為9％，繼續(xù)微波加熱水解12min；之后調(diào)整參數(shù)pH8，溫度55℃加入胰蛋白酶E/S為10％，繼續(xù)微波加熱水解20min，最后滅酶、離心、真空冷凍干燥，得到三酶水解大豆肽，其AN為129.05mmol/L。水解效果明顯高于單酶、雙酶。 2．毛細(xì)管分離檢測(cè)條件以100mmol

6、/LTris/HCl(pH8.5)+3.5mmol/LSDS+0.1％PEO為緩沖液，進(jìn)樣時(shí)間10S，運(yùn)行電壓18KV，氣動(dòng)進(jìn)樣，用：HPCE以無膠篩分方式，成功將大豆多肽進(jìn)行了分離和檢測(cè)。 3．凝膠排阻色譜法分離純化條件酶水解凍干物采用Sephadex-G50柱(2*30cm)進(jìn)行凝膠過濾層析分離，以(0.1mol/LNaCl+50mmol/LTris/pH 8)溶液平衡和洗脫，洗脫速度3.0 mL/10min，每管收集3.0

7、mL，于280nm處進(jìn)行檢測(cè)，收集4個(gè)組分洗脫液。 4．反相高效液相色譜的分離條件RPLC色譜柱對(duì)大豆多肽樣品的分離過程中，對(duì)其進(jìn)樣量和洗脫梯度進(jìn)行了選擇，每次進(jìn)樣量為20uL，，線性梯度模式為：30％-60％B，80min線性：檢測(cè)波長(zhǎng)220hm，在此最佳色譜條件下，大豆肽得到了初步分離。 5．大豆多肽理化性質(zhì)經(jīng)對(duì)大豆肽氨基酸分析得知，大豆肽的組成幾乎完全與大豆蛋白一樣，具有氨基酸比例平衡、含量豐富的特點(diǎn)。通過電泳和凝