滇蛙皮膚抗感染多肽的分離純化、分子克隆及多樣性研究.pdf

1、抗菌肽(Antimicrobial peptides，AMPs)是一類(lèi)小分子多肽(分子量低于10 KDa)，最早因?yàn)榫哂袕V譜抗菌活性被發(fā)現(xiàn)及命名，后來(lái)因?yàn)椴蝗菀渍T導(dǎo)微生物產(chǎn)生耐藥性而引起世界范圍內(nèi)的廣泛關(guān)注。隨著研究的不斷深入，人們發(fā)現(xiàn)：抗菌肽是先天免疫最終效應(yīng)物之一，在防御和消除外來(lái)病原體(細(xì)菌、真菌、病毒、原蟲(chóng)等)對(duì)機(jī)體的侵襲和破壞、維持機(jī)體正常的生理機(jī)能等方面發(fā)揮重要的作用，是炎癥反應(yīng)、免疫激活和創(chuàng)傷愈合等過(guò)程中的重要活性因子。在

2、植物、動(dòng)物(昆蟲(chóng)、兩棲類(lèi)、人類(lèi))、甚至微生物體內(nèi)都發(fā)現(xiàn)有抗菌肽(樣)的存在?？垢腥径嚯?Anti-infective peptides)概念的提出，對(duì)抗菌肽在名稱(chēng)上進(jìn)行了功能性的修正。 兩棲類(lèi)皮膚分泌液是抵御微生物侵染的第一道防御屏障，自1987年Zasloff等人從非洲爪蟾皮膚中分離到Magainin以來(lái)，各國(guó)學(xué)者對(duì)兩棲類(lèi)皮膚分泌液的研究越來(lái)越廣泛和深入起來(lái)。滇蛙(Rana pleuraden)，是我國(guó)特有種之一，主要分布在我

3、國(guó)云南、貴州、四川等地，藥用及經(jīng)濟(jì)價(jià)值尚未被發(fā)掘，有廣闊的開(kāi)發(fā)利用空間。 在本論文中，我們利用生物化學(xué)及分子生物學(xué)的手段對(duì)滇蛙皮膚的抗感染多肽進(jìn)行了研究。 通過(guò)兩步法(Sephadex G-50和RP-HPLC)對(duì)滇蛙皮膚分泌液的成分進(jìn)行分離純化，我們得到2種具有抗菌活性的多肽，命名為pleurain-A1和pleurain-A2。Edman降解法測(cè)定其全序列，分別是SIITMTKEAKLPQLWKQIACRLYNTC和

4、SIITMTKEAKLPQSWKQIACRLYNTC。運(yùn)用基質(zhì)輔助激光解離離子化技術(shù)(MALDI-TOF-MS)測(cè)定其分子量分別為3048.5 Da和3024.8 Da。 使用CLONTECH公司的CreatorTM SMARTTM cDNA Library Construction Kit構(gòu)建了滇蛙皮膚的cDNA文庫(kù)，根據(jù)蛋白序列比對(duì)，以相近的抗菌肽信號(hào)肽N端序列設(shè)計(jì)引物序列，我們從滇蛙皮膚抗感染多肽亞克隆文庫(kù)中，篩選得到13

5、5條由抗菌肽信號(hào)肽編碼的抗感染多肽cDNA核酸序列(GenBank accession no.： EF613243-EF613259，EF621707-EF621709，EU138029-EU138143)，編碼34種多肽，分屬于12個(gè)抗菌肽家族，pleurain-As(4個(gè))，pleurain-Bs(4個(gè))，pleurain-Cs(2個(gè))，pleurain-Ds(6個(gè))，pleurain-E(1個(gè))，pleurain-F(1個(gè))，pl

6、eurain-Gs(9個(gè))，pleurain-Js(2個(gè))，pleurain-K(1個(gè))，Lividin-RP(1個(gè))，pleurain-Ms(2個(gè))，pleurain-N(1個(gè))。對(duì)這些抗感染多肽的分子多樣性進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，這12個(gè)家族的抗菌肽前體序列的SPD區(qū)域(Signal and PropieceDomain，SPD)非常保守，Mega及DAMBE分子遺傳分析表明，它們可能起源于同一個(gè)祖先基因。對(duì)其進(jìn)行同義突變率及錯(cuò)義突變率檢測(cè)發(fā)

7、現(xiàn)，它們可能經(jīng)受著不同的選擇壓力。 隨機(jī)選取10個(gè)家族的抗感染多肽進(jìn)行人工合成，研究其生物學(xué)功能多樣性發(fā)現(xiàn)：pleurain-A1，pleurain-D4，pleurain-G7，pleurain-M1具有廣譜的抗微生物活性，pleurain-J1表現(xiàn)出較窄的抗菌譜(抗金黃色葡萄球菌)，而其他家族的肽類(lèi)物質(zhì)并不直接具有殺死微生物的能力。同一家族的抗感染多肽pleurain-G1和pleurain-G7表現(xiàn)出明顯不同的抗菌活性，p