基于RCA放大效應(yīng)及納米粒子的高靈敏蛋白質(zhì)檢測(cè)方法研究.pdf

1、蛋白質(zhì)是一類重要的生物標(biāo)志物，許多腫瘤生物標(biāo)志物就屬于酶類、抗原類物質(zhì)及微球蛋白、鐵蛋白等蛋白類物質(zhì)。蛋白質(zhì)免疫分析在生命科學(xué)研究中具有重要意義，廣泛應(yīng)用于生物學(xué)、醫(yī)學(xué)診斷等方面。目前常用的蛋白質(zhì)檢測(cè)方法有RIA(Radioimmunoassay，放射免疫實(shí)驗(yàn))、ELISA(Enzyme-linked immunosorbentassay，酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn))、蛋白免疫印跡等方法，這些方法在蛋白質(zhì)檢測(cè)和定量中發(fā)揮著重要的作用。隨著生命科學(xué)

2、的發(fā)展，已有方法的局限性已日益顯露出來(lái)，在一些特殊需要領(lǐng)域如疾病早期診斷等高靈敏度的檢測(cè)領(lǐng)域大大受限。所以研究普遍適用性好、操作簡(jiǎn)便、靈敏度高的蛋白質(zhì)免疫檢測(cè)新方法顯得越來(lái)越迫切。目前，核苷酸通過(guò)RCA擴(kuò)增放大技術(shù)使其檢測(cè)限低至幾個(gè)分子水平，大大高于蛋白質(zhì)的檢測(cè)限，因此本研究利用核酸和蛋白質(zhì)的關(guān)系通過(guò)檢測(cè)核酸的量實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)的超靈敏度檢測(cè)。 本研究分三部分： 第一部分：基于核酸識(shí)體(aptamer)的滾環(huán)DNA擴(kuò)增反應(yīng)用于

3、PDGF-BB的檢測(cè)。提出了一種新穎的、高靈敏的基于抗體一抗原一核酸識(shí)體夾心法和DNA滾環(huán)擴(kuò)增(RCA)的方法用于血小板源生長(zhǎng)因子BB(PDGF-BB)的檢測(cè)。在aptamer的3’端連接RCA反應(yīng)的引物，在Ф29 DNA聚合酶、脫氧核糖核苷酸及環(huán)形模板存在下，經(jīng)過(guò)滾環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)后，可得到一條與環(huán)形DNA模板互補(bǔ)的重復(fù)序列的DNA單鏈，利用生物素標(biāo)記的互補(bǔ)寡核苷酸探針與擴(kuò)增產(chǎn)物雜交，再用親和素標(biāo)記的堿性磷酸酶與之反應(yīng)，將反應(yīng)后的產(chǎn)物在底物

4、溶液中進(jìn)行銀沉積反應(yīng)，最后用電化學(xué)方法檢測(cè)電極表面沉積的銀的量，通過(guò)檢測(cè)銀的量來(lái)達(dá)到檢測(cè)PDGF-BB的目的?？疾炝丝贵w固定化濃度、RCA反應(yīng)時(shí)間和其它蛋白對(duì)測(cè)定信號(hào)的影響。結(jié)果表明，RCA擴(kuò)增反應(yīng)能顯著提高檢測(cè)的靈敏度，降低檢測(cè)下限。PDGF-BB在0.5pg/mL～8000pg/mL的范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，檢測(cè)下限為0.2pg/mL。該方法在蛋白質(zhì)的檢測(cè)和醫(yī)學(xué)診斷等方面有很大的應(yīng)用前景。 第二部分：脂質(zhì)體滾環(huán)DNA擴(kuò)增反

5、應(yīng)用于PSA的超靈敏檢測(cè)。研究了一種新型的基于脂質(zhì)體信號(hào)放大的超靈敏免疫分析方法用于檢測(cè)前列腺特異性抗原(PSA)。將DNA寡核苷酸包埋在脂質(zhì)體中，它的序列與后續(xù)滾環(huán)DNA擴(kuò)增反應(yīng)(RCA)反應(yīng)所需引物的序列一樣。再在脂質(zhì)體的表面包被好PSA的抗體。在微孔板上固定好PSA的抗體，與PSA抗原反應(yīng)后再將包被了抗體的脂質(zhì)體與之反應(yīng)，再用表面活性劑將結(jié)合上的脂質(zhì)體溶解，超聲破碎，包埋在脂質(zhì)體中的DNA寡核苷酸被釋放出來(lái)。這些DNA寡核苷酸就充

6、當(dāng)了RCA反應(yīng)的引物，在Ф29 DNA聚合酶、脫氧核糖核苷酸及環(huán)形模板存在下，經(jīng)過(guò)滾環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)后，可得到一條與環(huán)形DNA模板互補(bǔ)的重復(fù)序列的DNA單鏈，利用熒光素標(biāo)記的互補(bǔ)寡核苷酸探針和生物素標(biāo)記的互補(bǔ)寡核苷酸探針與擴(kuò)增產(chǎn)物雜交，再用親和素標(biāo)記的微珠捕獲反應(yīng)產(chǎn)物，最后通過(guò)檢測(cè)熒光信號(hào)的強(qiáng)度來(lái)達(dá)到檢測(cè)PSA的目的。該方法通過(guò)兩步放大，即在脂質(zhì)體中包埋大量的DNA寡核苷酸和進(jìn)行滾環(huán)DNA擴(kuò)增反應(yīng)，使得檢測(cè)PSA的靈敏度大大提高，檢測(cè)下限大大

7、降低，達(dá)到1×10<'-18>g/ml。由于DNA寡核苷酸的序列是多種多樣的，這使得這種檢測(cè)方法有很大的應(yīng)用前景，可用來(lái)檢測(cè)多種蛋白質(zhì)，在疾病研究、醫(yī)學(xué)診斷上有極為重要的意義。 第三部分：基于納米金介導(dǎo)生物沉積鉑并以鉑催化氫還原伏安法進(jìn)行檢測(cè)的高靈敏電化學(xué)免疫分析新方法。該方法采用夾心免疫分析模式，實(shí)現(xiàn)了人免疫球蛋白(HIgG)的測(cè)定。首先在聚苯乙烯微孔板中固定羊抗HIgG捕獲抗體，HIgG捕獲后，堿性磷酸酶標(biāo)記的HIgG抗體修

8、飾的納米金探針通過(guò)與HIgG形成夾心復(fù)合物而結(jié)合在微孔板上。結(jié)合的堿性磷酸酶催化抗壞血酸磷酸酯底物水解產(chǎn)生抗壞血酸，后者在納米金上介導(dǎo)下還原鉑離子沉積于納米金表面。沉積的金屬鉑用王水溶解并電富集于玻碳電極上。通過(guò)測(cè)定鉑催化氫還原產(chǎn)生的陰極電流，可實(shí)現(xiàn)HIgG的高靈敏分析。催化氫還原電流與HIgG濃度對(duì)數(shù)在0.1～100ng/ml之間呈線性相關(guān)性，檢測(cè)下限達(dá)22pg/ml。由于鉑催化氫還原的高靈敏度及納米金介導(dǎo)的生物沉積放大反應(yīng)，該法具有