基于磁性納米粒子及發(fā)光技術(shù)的銅綠假單胞菌高靈敏檢測(cè)及分型方法研究.pdf

1、銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa，P.aeruginosa)是一種投機(jī)主義的革蘭氏陰性菌，易在免疫力低下個(gè)體中盛行，因此在醫(yī)院和社區(qū)獲得性感染病例中許多是由P.aeruginosa引起的。P.aeruginosa是目前各種醫(yī)院內(nèi)感染中最廣泛、最嚴(yán)重的問(wèn)題之一，感染率居病原菌之首。由于P.aeruginosa在濃度很低的時(shí)候就能引起感染，因此早期檢測(cè)對(duì)于治療P.aeruginosa引起的感染至關(guān)重要。納米技術(shù)在過(guò)

2、去二十年取得了飛速的發(fā)展，由于其具有高表面積以及容易被外部磁場(chǎng)控制等特點(diǎn)，已經(jīng)為快速自動(dòng)化生物分子檢測(cè)開(kāi)啟了一扇新的大門(mén)。本研究擬利用磁性納米技術(shù)建立易于實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化的P.aeruginosa高靈敏檢測(cè)及分型方法。具體研究?jī)?nèi)容如下。
　　1、超分散性磁性納米粒子(MNPs)的制備及表面修飾
　　由于MNPs在眾多領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用，合成不同類(lèi)型的MNPs一直是研究的熱點(diǎn)。我們以PEG-4000為表面活性劑，通過(guò)高溫溶劑熱法制備了一

3、種高分散性的MNPs。研究結(jié)果表明，在最佳條件下合成的MNPs粒徑在350-450 nm之間，具有良好的分散性和非常窄的粒徑分布。沉降實(shí)驗(yàn)顯示，合成的MNPs與商品化MNPs MP10101相比沉降時(shí)間大大增長(zhǎng)，12小時(shí)后仍保持良好的分散性。為了獲得更加穩(wěn)定的功能化粒子，我們?cè)贛NPs表面進(jìn)行了層層修飾，SEM、TEM及FTIR等分析表征手段證明得到的功能化MNPs具有良好的分散性及均一的形貌。元素分析及能量圖譜結(jié)果顯示MNPs@Pro

4、be表面P元素含量為0.33％。
　　2、建立了基于磁富集PCR及磁富集巢式PCR的P.aeruginosa高靈敏檢測(cè)方法
　　P.aeruginosa是一種臨床上常見(jiàn)的條件致病菌，也是威脅人類(lèi)健康的主要因素之一。由于核酸自動(dòng)化檢測(cè)發(fā)展的必然趨勢(shì)，近幾年來(lái)基于MNPs的基因組DNA分離和檢測(cè)技術(shù)得到了快速發(fā)展。本論文以P.aeruginosa特異性基因gyrB為研究對(duì)象，優(yōu)化并建立了一種磁富集PCR方法。在相同菌液濃度的條件

5、下，磁富集PCR與傳統(tǒng)PCR相比因具有更高的模板利用率，所以擴(kuò)增效率更高。構(gòu)建的檢測(cè)方法可以有效地檢測(cè)到100 cfu/mL的P.aeruginosa。在磁富集PCR的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步發(fā)展了ecfX基因的磁富集巢式PCR，建立了高特異性、高靈敏度的檢測(cè)方法。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該方法有良好的特異性和靈敏度，P.aeruginosa的最低檢出濃度為10cfu/mL。該方法不僅為P.aeruginosa高靈敏早期檢測(cè)提供了技術(shù)基礎(chǔ)，也縮短了從核酸抽提

6、到樣本檢測(cè)的時(shí)間和簡(jiǎn)化了操作步驟，為實(shí)現(xiàn)快速自動(dòng)化檢測(cè)提供了新的思路。
　　3、利用磁富集PCR、磁分離技術(shù)及化學(xué)發(fā)光技術(shù)構(gòu)建了P.aeruginosa的超靈敏檢測(cè)方法
　　盡管磁富集巢式PCR方法可以實(shí)現(xiàn)P.aeruginosa高靈敏檢測(cè)，但是由于其難以實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化及定量檢測(cè)，在臨床檢驗(yàn)受到了諸多限制。為此，基于磁富集PCR、磁分離及化學(xué)發(fā)光技術(shù)，建立了一種P.aeruginosa易于實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化的超靈敏定量檢測(cè)方法，并對(duì)該方

7、法進(jìn)行了條件優(yōu)化。我們用該方法檢測(cè)了3株P(guān).aeruginosa標(biāo)準(zhǔn)菌株(ATCC27853、ATCC9027及CMCC10104)。結(jié)果顯示，樣本的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度與對(duì)照相比均具有顯著性差異且Q值大于2.1。靈敏度研究結(jié)果顯示，該方法能檢測(cè)到30 fM的PCR產(chǎn)物及10 cfu/mL的樣本。該方法對(duì)大腸桿菌、腸炎沙門(mén)氏菌、痢疾志賀氏菌及金黃色葡萄球菌樣本檢測(cè)結(jié)果均為陰性，表明具有較高的特異性。
　　4、建立了基于磁富集多重PCR及化

8、學(xué)發(fā)光的P.aeruginosa T3SS基因分型方法
　　本研究利用磁富集多重PCR和化學(xué)發(fā)光技術(shù)建立了一種T3SS基因的快速分型方法。我們使用該方法對(duì)三個(gè)P.aeruginosa標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC27853、ATCC9027及CMCC10104進(jìn)行了分型驗(yàn)證。結(jié)果表明，這三個(gè)菌株的T3SS基因中，exoT、 exoY、 exoS三個(gè)基因化學(xué)發(fā)光值都大于對(duì)照10倍以上，Q值也均大于2.1，三個(gè)標(biāo)準(zhǔn)株exoU的Q值均少于2.1。檢測(cè)

9、結(jié)果與電泳結(jié)果相符合，說(shuō)明建立的方法是可靠的。利用該方法對(duì)22株臨床樣本進(jìn)行了T3SS基因型的研究。結(jié)果表明，在22個(gè)臨床樣本中，100％的樣本中含有exoT基因，72.7％的樣本含有exoY基因，95.5％的樣本含有exoS基因，4.5％的樣本含有exoU基因，exoS與exoU基因不能同時(shí)存在于同一菌株中。臨床樣本分型的所有結(jié)果均與PCR分型結(jié)果一致。
　　5、結(jié)合磁富集及磁分離雙色熒光雜交技術(shù)建立了exoS基因SNP分型方法

10、
　　P.aeruginosa T3SS的exoU、exoS、exoT及exoY四個(gè)毒力基因都含有SNP位點(diǎn)。前面研究顯示22個(gè)臨床樣本中95.5％含有exoS。結(jié)合磁富集PCR、磁分離及雙色熒光雜交技術(shù)，建立了exoS基因G162A及G434C位點(diǎn)SNP分型方法，為了解P.aeruginosa T3SS基因型的變異提供了技術(shù)基礎(chǔ)。利用這個(gè)方法對(duì)三株標(biāo)準(zhǔn)菌株分別進(jìn)行了這兩個(gè)位點(diǎn)的SNP分型研究。結(jié)果表明三個(gè)標(biāo)準(zhǔn)菌株的兩個(gè)SNP位點(diǎn)