氨基酸、多肽、蛋白質(zhì)輔助原位制備金納米粒子的研究.pdf

1、由于容易合成、化學(xué)穩(wěn)定性好、具有獨(dú)特的光學(xué)性質(zhì)等優(yōu)點(diǎn)，人們廣泛地研究金納米粒子在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用。近些年來，科學(xué)家們越來越關(guān)注金納米粒子的生物安全性問題。然而到目前為止，納米粒子的穩(wěn)定性、尺寸、組成、表面化學(xué)等理化參數(shù)以及對生物環(huán)境中化合物的吸附等與納米粒子生物毒性的關(guān)系仍然不清楚。選擇合適的試劑以及方法制備具有生物相容性的金納米粒子具有十分重要的意義。
　　氨基酸、多肽、蛋白具有來源廣泛、價格低廉、生物相容性好等優(yōu)點(diǎn)，并且它們

2、本身含有豐富的官能團(tuán)，適合于制備和修飾金納米粒子。本論文利用氨基酸、多肽、蛋白在綠色、溫和的條件下原位還原制備金納米粒子，并考察所得到的金納米粒子的生物相容性。論文主要包括以下幾個部分的工作:
　　1.我們在pH10條件下通過紫外輻照氨基酸（天冬氨酸、甘氨酸、亮氨酸、賴氨酸或絲氨酸）與四氯金酸的混合溶液制備了具有不同氨基酸表面的金納米粒子(Au@AA: Au@Asp、Au@Gly、Au@Leu、Au@Lys和Au@Ser)。我們發(fā)

3、現(xiàn)紫外輻照是一個可控、有效的還原制備金納米粒子的方法，該方法不需要其他化學(xué)試劑，也不需要分離純化。其中，氨基酸通過氨基吸附在金納米粒子表面而羧基朝外穩(wěn)定金納米粒子。在pH7.4條件下，各種金納米粒子的流體力學(xué)直徑在15-47 nm的范圍內(nèi);而在含有10％胎牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)基中孵育48 h后，各種金納米粒子具有相近的流體力學(xué)直徑(62-73 nm)。通過對蛋白自身熒光淬滅的表征，我們發(fā)現(xiàn)牛血清白蛋白(BSA)與人血清白蛋白(HSA)能夠通

4、過特殊作用吸附到Au@AA表面，繼而減少金納米粒子在細(xì)胞培養(yǎng)基中的聚集，并且減少金納米粒子的細(xì)胞攝入。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明金納米粒子的細(xì)胞攝入與細(xì)胞毒性沒有直接的相關(guān)性。具有兩親性表面的Au@Leu和Au@Lys比其他金納米粒子具有更好的生物相容性。
　　2.我們發(fā)展了一個綠色、簡單的方法制備負(fù)載有金納米粒子的蛋白-多糖納米凝膠。我們利用溶菌酶-葡聚糖納米凝膠同時作為還原劑和穩(wěn)定劑制備了具有良好生物相容性的負(fù)載有金納米粒子的溶菌酶-

5、葡聚糖(Au@Lyso-Dex)納米凝膠。溶菌酶-葡聚糖納米凝膠的尺寸在200 nm左右，具有以溶菌酶為核葡聚糖為殼的結(jié)構(gòu)。在pH4條件下，氯金酸根離子通過靜電吸引和配位作用與溶菌酶結(jié)合。在紫外輻照下，溶菌酶中芳香族氨基酸產(chǎn)生的活性自由基以及水合電子原位還原氯金酸根離子形成8nm左右的金納米粒子，并且金納米粒子被包裹在納米凝膠中。所得到的Au@Lyso-Dex納米凝膠具有良好的生物相容性和長期穩(wěn)定性。通過物理擴(kuò)散的方法Au@Lyso-D

6、ex納米凝膠能夠有效包埋抗腫瘤藥物阿霉素，并且包埋了阿霉素的納米凝膠(Dox/Au@Lyso-Dex)具有與自由阿霉素相同的體外抗腫瘤效果。Dox/Au@Lyso-Dex納米凝膠還可以作為細(xì)胞造影劑，同時觀察金納米粒子和阿霉素在亞細(xì)胞層面的分布情況。Dox/Au@Lyso-Dex納米凝膠在同步實(shí)現(xiàn)藥物輸送和生物成像方面具有潛在的應(yīng)用價值。
　　3.我們利用制各級反相高效液相色譜-電噴霧質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(RP-HPLC/ESI-MS)制

7、備了低成本的酪蛋白酶解多肽。我們利用胰蛋白酶對酪蛋白進(jìn)行了充分的降解，采用分析級RP-HPLC/ESI-MS分析了酶解產(chǎn)物各組分的組成，并且通過改變流動相的梯度洗脫程序優(yōu)化了分析級色譜條件。我們將優(yōu)化的分析級色譜條件直接放大到制備級RP-HPLC中，在程序控制下通過紫外吸收信號結(jié)合ESI-MS信號共同引導(dǎo)實(shí)現(xiàn)了多肽的全自動化分離和收集，得到了多個純的多肽片段。整個過程方便快捷。除此之外，我們還考察了流動相的pH值、柱上樣量等因素對該體系

8、制備級分離的影響，并對一次分離中分辨率不好的親水性多肽混合物進(jìn)行了二次分離，得到了多個不同的純多肽片段。
　　4.我們研究了YR10多肽(氨基酸序列YLGYLEQLLR)原位制備金納米粒子以及其自組裝的行為。承接上一章的工作，我們從酪蛋白酶解多肽中選取了具有兩親性的YR10多肽，首先研究了它在酸性溶液中的自組裝行為，發(fā)現(xiàn)在pH2條件下YR10多肽能夠自組裝形成直徑10nm左右、長度為幾個微米的納米纖維，該纖維具有β-折疊結(jié)構(gòu)，并且

9、是由多根更小的纖維組成。我們利用YR10多肽在不同pH條件下制備金納米粒子，發(fā)現(xiàn)在中性或堿性條件下，通過加熱或紫外輻照都可以制備粒徑小于10nm的金納米粒子。在酸性和室溫條件下，YR10多肽在原位制備金納米粒子的同時發(fā)生了組裝，形成了直徑400 nm左右的球狀組裝體，這些球狀組裝體含有許多10nm左右的金納米粒子。我們發(fā)現(xiàn)升高溫度能夠減小球狀組裝體的尺寸。我們通過TEM、光散射、ζ-電位以及紫外可見光譜對體系隨時間的變化進(jìn)行了跟蹤，發(fā)現(xiàn)