絲肽的制備及其組裝行為研究.pdf

1、多肽自組裝是近年來(lái)一個(gè)新的研究熱點(diǎn)。通過(guò)自組裝，多肽分子可以自發(fā)組合形成一系列具有一定結(jié)構(gòu)和功能的新型納米材料，如納米纖維、水凝膠、納米管、膠束及表面活性劑等。這些材料在醫(yī)學(xué)、組織工程、藥物緩釋及生物材料表面工程等方面有著巨大的應(yīng)用潛力。目前，用于自組裝研究的多肽主要是通過(guò)化學(xué)合成法或基因工程技術(shù)獲得，研究者根據(jù)自己的研究需要對(duì)多肽的序列進(jìn)行人工設(shè)計(jì)，使其具有相應(yīng)的組裝功能。但通過(guò)這些技術(shù)獲取多肽的成本相對(duì)較高且周期較長(zhǎng)，使多肽的應(yīng)用尤

2、其多肽的自組裝材料的應(yīng)用研究受到了很大的限制，因而尋求一種快速、有效且成本低廉的手段來(lái)獲取具有一定功能的多肽片段已成為該領(lǐng)域的重要研究課題。
　　在本論文中，采用“top-down”的方法來(lái)獲取多肽，即通過(guò)酶降解技術(shù)從天然絲素蛋白中直接獲取我們所需要的目標(biāo)多肽，然后進(jìn)一步研究這些多肽的組裝行為。我們選擇廉價(jià)、來(lái)源廣泛且序列高度重復(fù)的天然桑蠶絲素蛋白作為原材料，采用酶降解技術(shù)和反相高效液相色譜技術(shù)最終得到一系列具有一定產(chǎn)量和純度、且

3、具有明確一級(jí)結(jié)構(gòu)的絲肽片段，然后對(duì)其組裝行為進(jìn)行研究。
　　首先，用α-胰凝乳蛋白酶和彈性蛋白酶分別在水溶液中水解絲素蛋白以分別獲得來(lái)自晶區(qū)和非晶區(qū)的絲肽片段。α-胰凝乳蛋白酶水解位于絲素蛋白非晶區(qū)的苯丙氨酸(Phe)、色氨酸(Trp)和酪氨酸(Tyr)等疏水氨基酸的羧基端;彈性蛋白水解位于絲素蛋白晶區(qū)和非晶區(qū)的丙氨酸(Ala)和甘氨酸(Gly)等脂肪族氨基酸的羧基端。將經(jīng)降解后的絲素蛋白水溶液用反相高效液相色譜分離純化以獲得目標(biāo)

4、絲肽。并且通過(guò)核磁共振、質(zhì)譜和多肽測(cè)序等手段進(jìn)一步分析了所得絲肽的組成及氨基酸序列。這種酶解絲肽的分離純化方法為絲素多肽的組裝研究提供了一種獲取原料的新方法。
　　在酶解多肽分離純化的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，我們研究了SFC-1（silk fibroincrystalline-1）多肽在水溶液中的自組裝行為。SFC-1是位于絲素蛋白晶區(qū)的一段基序，其序列為GAGSGAGAGSGA。研究發(fā)現(xiàn)，SFC-1在水溶液中可以自組裝形成纖維，溶液濃度為0

5、.05 mg/ml時(shí)，組裝體主要以短的剛性纖維為主;當(dāng)溶液濃度提高到0.5 mg/ml時(shí)，組裝體則以致密的纖維網(wǎng)絡(luò)為主;當(dāng)濃度提高到20 mg/ml時(shí)就可以形成水凝膠。SFC-1多肽的二級(jí)結(jié)構(gòu)以反平行β-折疊為主，同時(shí)，多肽鏈方向垂直于纖維軸，其分子間的氫鍵與纖維軸方向平行，即形成類似于淀粉樣蛋白纖維中的cross-β結(jié)構(gòu)。因此，我們可以利用SFC-1這種序列簡(jiǎn)單的多肽為模型，探索其成纖機(jī)理，其結(jié)果不僅有助于增強(qiáng)對(duì)絲素蛋白結(jié)構(gòu)的認(rèn)識(shí)，也

6、為研究老年癡呆癥、瘋牛病等成纖機(jī)理提供一定的參考依據(jù)。我們進(jìn)一步考察了溫度變化對(duì)SFC-1多肽在水溶液中二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其具有可逆的熱致構(gòu)象轉(zhuǎn)變行為，即隨著溫度升高，SFC-1多肽水溶液的構(gòu)象會(huì)由β-折疊逐步轉(zhuǎn)變?yōu)闊o(wú)規(guī)卷曲，溶液冷卻后并放置一段時(shí)間，溶液的構(gòu)象又會(huì)恢復(fù)為β-折疊，但需要較長(zhǎng)的時(shí)間。此外，我們利用SFC-1自組裝纖維為模板成功地誘導(dǎo)了金納米粒子的形成，粒徑約為3nm的金納米粒子且其沿著纖維軸排列，這可能為以后進(jìn)行納

7、米金屬材料及相關(guān)功能材料的制備提供了借鑒。
　　接著，我們研究了SFA-1（silk fibroin amorphous-1）多肽在固體基質(zhì)表面的組裝行為。SFA-1是位于絲素蛋白非晶區(qū)的一段基序，其序列為GAGAGAGY。研究發(fā)現(xiàn)，SFA-1多肽水溶液直接在固體表面干燥后的二級(jí)結(jié)構(gòu)為無(wú)規(guī)卷曲，其聚集體結(jié)構(gòu)主要以不規(guī)則的粒子存在;而SFA-1多肽水溶液中混有一定體積的正丁醇后，其在固體表面干燥后二級(jí)結(jié)構(gòu)卻為反平行的β-折疊結(jié)構(gòu)，且

8、其聚集體結(jié)構(gòu)主要以纖維存在。這種纖維結(jié)構(gòu)形成的原因可能為:正丁醇加入SFA-1多肽溶液后使溶劑極性降低，由于溶劑效應(yīng)的作用，促使樣品分子在固體表面有序排列，通過(guò)分子間氫鍵、疏水作用及苯環(huán)間的π-π堆積力的協(xié)同作用，促使SFA-1多肽分子聚集形成纖維結(jié)構(gòu)。此外，我們用甲酸作為溶劑時(shí)，溶液在固體表面干燥后同樣可以組裝形成纖維結(jié)構(gòu)。
　　最后，我們采用傳統(tǒng)的以Fmoc為保護(hù)基的固相合成法合成了GS(序列為GAGAGAGS)多肽，通過(guò)與前

9、述酶解多肽SFA-1(GAGAGAGY)的組裝行為相比較，研究氨基酸組成和結(jié)構(gòu)在短肽的組裝中所起的重要作用。研究顯示，GS多肽在水溶液中的構(gòu)象隨著時(shí)間變化逐漸由無(wú)規(guī)線團(tuán)轉(zhuǎn)變?yōu)橐驭?折疊為主，其組裝形貌隨著時(shí)間變化由粒子轉(zhuǎn)變?yōu)槔w維，并且纖維之間存在交叉纏繞現(xiàn)象，而SFA-1多肽卻沒(méi)有明顯的組裝行為。由此表明，GS多肽和SFA-1多肽之間雖然僅有一個(gè)C-端氨基酸殘基的差異，但在水溶液中，由于SFA-1多肽C-端酪氨酸殘基上苯環(huán)的位阻效應(yīng)，阻