基于免疫磁分離和核酸適配子技術(shù)快速檢測(cè)食源性致病菌的研究.pdf

1、食源性致病菌引發(fā)的食品安全問(wèn)題對(duì)人類(lèi)健康構(gòu)成了嚴(yán)重威脅，全球急需建立監(jiān)測(cè)體系，發(fā)展快速、特異和靈敏的檢測(cè)方法來(lái)判知食源性致病菌對(duì)食物的污染，應(yīng)對(duì)其危害。傳統(tǒng)的食源性致病菌檢測(cè)方法存在耗時(shí)、勞動(dòng)強(qiáng)度大等缺點(diǎn)，不能滿(mǎn)足現(xiàn)代食品工業(yè)對(duì)微生物實(shí)時(shí)監(jiān)控的要求。目前，常用快速檢測(cè)方法主要有：（1）基于分子生物學(xué)的方法；（2）基于特異性識(shí)別的方法。本文結(jié)合上述兩類(lèi)方法，建立了常見(jiàn)食源性致病菌（大腸桿菌O157:H7、金黃色葡萄球菌、鼠傷寒沙門(mén)氏菌和宋

2、內(nèi)氏志賀氏菌）的快檢方法，分述如下：
　　（1）大腸桿菌O157:H7活菌的IMS-PMA-IAC-PCR檢測(cè)體系的建立
　　采用免疫磁分離（IMS）技術(shù)捕獲大腸桿菌O157:H7，疊氮溴化丙錠（PMA）處理大腸桿菌O157:H7，抑制細(xì)胞膜受損死菌DNA的PCR擴(kuò)增，同時(shí)在PCR體系中加入一條擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)（ IAC），排除PCR抑制劑引起的假陰性結(jié)果，建立了大腸桿菌O157:H7活菌的IMS-PMA-IAC-PCR檢測(cè)體系。結(jié)

3、果表明：當(dāng)大腸桿菌O157:H7菌體濃度從102 CFU/mL增到107 CFU/mL時(shí)，磁珠捕獲效率從100％降到87%。PMA能夠有效地抑制細(xì)胞膜受損的死菌DNA的PCR擴(kuò)增。IMS-PMA-IAC-PCR方法在純培養(yǎng)物中的檢測(cè)限是2.1×102 CFU/mL；在人工污染的牛奶樣品中則為5×103 CFU/mL。
　?。?）大腸桿菌O157:H7活菌的IMS-SD-PMA-qPCR檢測(cè)體系的建立
　　進(jìn)一步結(jié)合脫氧膽酸鹽

4、(SD)和PMA處理細(xì)菌，排除了死菌（細(xì)胞膜完整和細(xì)胞膜損傷）的干擾，建立了檢測(cè)大腸桿菌O157:H7活菌的快速和靈敏的IMS-SD-PMA-qPCR方法。結(jié)果表明：SD處理細(xì)菌的最佳濃度和時(shí)間分別是0.1%（ m/v）和20 min。SD-PMA-qPCR方法與傳統(tǒng)平板計(jì)數(shù)方法相比，具有相似活菌檢測(cè)值，而qPCR和PMA-qPCR則具有較高的檢測(cè)值。IMS-SD-PMA-qPCR方法在純培養(yǎng)物中的檢測(cè)限是101 CFU/mL，在加標(biāo)的

5、牛奶中則為102 CFU/mL。
　　（3）沙門(mén)氏菌、志賀氏菌和金黃色葡萄球菌活菌的SD-PMA-IAC-mPCR檢測(cè)體系的建立
　　以沙門(mén)氏菌、志賀氏菌和金黃色葡萄球菌為研究對(duì)象，采用SD和PMA排除死菌（細(xì)胞膜完整和細(xì)胞膜損傷）DNA對(duì)PCR擴(kuò)增的干擾，建立靈敏、準(zhǔn)確的mPCR檢測(cè)方法。經(jīng)過(guò)參數(shù)優(yōu)化，在純培養(yǎng)物中沙門(mén)氏菌、志賀氏菌和金黃色葡萄球菌的檢測(cè)限分別為6.8×104、7.9×103和5.8×104 CFU/mL。

6、經(jīng)過(guò)15 h的預(yù)增菌，在加標(biāo)牛奶或牛肉餡中則為101 CFU/mL。
　?。?）基于QCM傳感器篩選鼠傷寒沙門(mén)氏菌核酸適配子方法的建立
　　QCM傳感器是一種對(duì)質(zhì)量非常敏感的檢測(cè)儀器，具有篩選核酸適配子和同時(shí)追蹤篩選過(guò)程中候選ssDNA庫(kù)親和力變化的能力。通過(guò)8輪正篩和2輪反篩，獲得了三條候選核酸適配子序列A24、B5和B30。采用最佳核酸適配子B5，建立了基于核酸適配子的QCM方法，可在1 h內(nèi)檢測(cè)到103 CFU/mL的