食源性致病菌PCR檢測策略的建立和優(yōu)化.pdf

1、研究背景：
　　通過該研究項目，利用PCR方法對14種引起食源性疾?。ㄊ澄镏卸荆┑闹虏∥⑸镞M(jìn)行檢測并獲得其最佳PCR反應(yīng)條件，根據(jù)每種食源性致病微生物PCR檢測基因的引物的退火溫度的高低以及擴(kuò)增產(chǎn)物片段的大小將其分組進(jìn)行PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，使多個測試項目在同一批次進(jìn)行PCR檢測，從而大大縮減了檢測時間，給現(xiàn)場疫情處理贏得時間。最終，建立一個快速、簡便、準(zhǔn)確、敏感、特異、有效的微生物檢測平臺，為突發(fā)事件現(xiàn)場調(diào)查處理及患者的治

2、療提供及時準(zhǔn)確的信息和依據(jù)。
　　研究方法：
　　從文獻(xiàn)中查找部分食源性致病菌的PCR擴(kuò)增引物序列，同時，在GenBank數(shù)據(jù)庫中查找部分食物性致病菌的特異性基因序列，再依據(jù)特異性的靶序列使用Primer5.0軟件進(jìn)行引物設(shè)計。依據(jù)退火溫度和擴(kuò)增片段的大小對14種食物中毒致病菌進(jìn)行分組，然后，對多重PCR和多項目同批次PCR的反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。
　　研究結(jié)果：
　　本文利用多重PCR和多項目同批次PCR技術(shù)對

3、14種食物中毒致病菌進(jìn)行了檢測方法的研究，取得了以下成果:
　　1.依據(jù)退火溫度與產(chǎn)物片段大小將14種致病菌分成三組，使它們能夠通過多項目同批次PCR一次性檢測出來。分組方案如下，第一方案:(1)沙門氏菌、副溶血性弧菌、阪崎腸桿菌、奇異變形桿菌、空腸彎曲菌，(2)志賀氏菌、腸出血性大腸埃希菌O157、金黃色葡萄球菌、單核細(xì)胞增生李斯特菌、創(chuàng)傷弧菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌，(3)蠟樣芽胞桿菌、溶血性鏈球菌、小腸結(jié)腸耶爾森菌;第二方案:(1)沙

4、門氏菌、志賀氏菌、副溶血性弧菌、創(chuàng)傷弧菌、空腸彎曲菌，(2)腸出血性大腸埃希菌O157、金黃色葡萄球菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌、阪崎腸桿菌、奇異變形桿菌，(3)單核細(xì)胞增生李斯特菌、蠟樣芽胞桿菌、溶血性鏈球菌、小腸結(jié)腸耶爾森菌。
　　2.優(yōu)化了多項目同批次PCR反應(yīng)體系的退火溫度、引物用量、靈敏度以及引物比例。多項目同批次PCR反應(yīng)體系的最佳退火溫度為52℃;最佳混合引物用量為0.6-0.8μL;基因組DNA檢測靈敏度可達(dá)到8×10-4ng

5、/μL;第一方案致病菌的最佳引物比例分別為1∶1∶3∶3∶2，1∶1∶1∶1∶3∶3，1∶1∶2;第二方案致病菌的最佳引物比例分別為1∶1∶1∶3∶2,1∶1∶3∶3∶2,1∶1∶1∶2。
　　3.利用多項目同批次PCR反應(yīng)體系的條件成功從3位食物中毒患者的嘔吐物、腹瀉物以及吃過的可疑食品樣品中檢出副溶血性弧菌。
　　4.將常規(guī)PCR與多重PCR的靈敏度和在食物中毒樣品檢測中的應(yīng)用效果進(jìn)行了比較。常規(guī)PCR的基因組DNA檢測