基于分子邏輯門的食源性致病菌DNA檢測技術(shù)研究.pdf

1、分子邏輯門最早是由DeSilva教授及其研究小組提出，他們于1993年首次將分子開關(guān)發(fā)展為分子邏輯門并在Nature期刊上報道了一種基于光誘導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移的分子邏輯門。本論文利用DNA分子邏輯門技術(shù)結(jié)合電化學(xué)方法，實現(xiàn)了對多種食源性致病菌的特征DNA進(jìn)行檢測。通過構(gòu)建標(biāo)記型發(fā)卡結(jié)構(gòu)DNA分子邏輯門、標(biāo)記發(fā)卡型莖部三螺旋結(jié)構(gòu)DNA分子邏輯門、非標(biāo)記型三螺旋結(jié)構(gòu)DNA分子邏輯門，分別實現(xiàn)了對大腸桿菌DNA、志賀氏菌DNA、沙門氏菌DNA這三種食

2、源性致病菌的同時準(zhǔn)確有效檢測。本論文主要內(nèi)容如下:
　　(1)緒論部分首先以食品安全與食源性致病菌檢測對保障食品安全的重要意義出發(fā)介紹食源性致病菌檢測的主要方法，且闡述了各類方法的研究進(jìn)展，對傳統(tǒng)方法與現(xiàn)代方法的優(yōu)缺點(diǎn)做了對比，重點(diǎn)介紹了本論文中應(yīng)用的檢測方法—DNA生物傳感器對食源性致病菌的檢測方法。緒論后半部分介紹了分子邏輯門的概念，以及與本論文研究方法密切相關(guān)的DNA分子邏輯門的分類及其研究進(jìn)展。
　　(2)構(gòu)建了一種

3、基于二茂鐵標(biāo)記型發(fā)卡結(jié)構(gòu)檢測大腸桿菌DNA、志賀氏菌DNA的“OR”型邏輯門。依據(jù)文獻(xiàn)及相關(guān)數(shù)據(jù)庫，借助專業(yè)軟件模擬計算，選擇合適的大腸桿菌特征基因序列、志賀氏菌特征基因序列。將其特征DNA作為目標(biāo)分子，由此設(shè)計符合條件的二茂鐵標(biāo)記型發(fā)卡結(jié)構(gòu)的DNA探針。以大腸桿菌DNA、志賀氏菌DNA作為輸入，修飾標(biāo)記二茂鐵探針分子的電極電流響應(yīng)信號作為輸出，構(gòu)建OR型邏輯門。達(dá)到快速同時檢測大腸桿菌DNA、志賀氏菌DNA的目的。當(dāng)輸入大腸桿菌DNA

4、、志賀氏菌DNA中任意一個或同時輸入兩個目標(biāo)DNA分子時，電流減小率＞54％，當(dāng)沒有目標(biāo)DNA出現(xiàn)時，電流減小率＜54％。檢測E.coli-DNA所得結(jié)果:回歸方程為:y=-0.0027x+4.575，相關(guān)系數(shù)R=0.9962，其線性范圍為:1.0×10-7-7.0×10-7mol/L，檢出限:1.0×10-7mol/L。檢測Shi-DNA所得結(jié)果:回歸方程y=-0.0037x+4.54，相關(guān)系數(shù)R=0.9973，線性范圍為:1.0×1

5、0-7-7.0×10-7mol/L，檢出限:1.0×10-7mol/L。
　　(3)構(gòu)建了一種基于二茂鐵標(biāo)記型發(fā)卡莖部三螺旋結(jié)構(gòu)檢測沙門氏菌DNA、志賀氏菌DNA的“OR”型邏輯門。參考相關(guān)數(shù)據(jù)庫，確定志賀氏菌特征基因序列、沙門氏菌特征基因序列。借助軟件進(jìn)行模擬計算，選擇合適的志賀氏菌、沙門氏菌特征基因序列檢測目標(biāo)，在上一個實驗原理基礎(chǔ)上加以改進(jìn)，設(shè)計二茂鐵標(biāo)記型莖部三螺旋結(jié)構(gòu)的發(fā)卡式DNA探針。以志賀氏菌DNA、沙門氏菌DNA作

6、為輸入，修飾標(biāo)記二茂鐵探針分子的電極電流響應(yīng)信號作為輸出，構(gòu)建OR型邏輯門。達(dá)到同時快速檢測志賀氏菌DNA、沙門氏菌DNA的目的。當(dāng)輸入沙門氏菌DNA、志賀氏菌DNA中任意一個或同時輸入兩個目標(biāo)DNA分子時電流減小率＞83％，當(dāng)沒有目標(biāo)DNA出現(xiàn)時，電流減小率＜83％。檢測Sal-DNA所得結(jié)果:回歸方程為:y=-1.29log(Csal/mol)-6.819，相關(guān)系數(shù)R=0.9974，線性范圍:3.0×10-7-2.5×10-11mo

7、l/L，檢出限:2.5×10-11mol/L。檢測Shi-DNA所得結(jié)果:回歸方程y=-1.26log(Cshi/mol)-6.496，相關(guān)系數(shù)R=0.9965，線性范圍為:3.0×10-7-2.5×10-11mol/L，檢出限:2.5×10-11mol/L。
　　(4)在前期工作基礎(chǔ)上，構(gòu)建了一種非標(biāo)記型三螺旋結(jié)構(gòu)同時檢測志賀氏菌DNA、沙門氏菌DNA的“AND”型邏輯門。選擇合適的志賀氏菌特征基因序列、沙門氏菌特征基因序列并設(shè)

8、計非標(biāo)記型三螺旋DNA探針。選用亞甲基藍(lán)作為電化學(xué)活性指示劑，利用亞甲基藍(lán)與DNA的相互作用，分別探究單鏈DNA、雙鏈DNA、三鏈DNA的雜交信號響應(yīng)。以志賀氏菌DNA、沙門氏菌DNA作為輸入，以亞甲基藍(lán)為指示劑的電極電化學(xué)信號作為輸出，構(gòu)建AND型邏輯門。達(dá)到快速同時檢測志賀氏菌、沙門氏菌DNA的目的。檢測Sal-DNA所得結(jié)果:回歸方程為:y=-1.207log(Csal/mol)x+14.172，相關(guān)系數(shù)R=0.9986，線性范圍